Fluorinated amino acids are powerful tools in the development of peptide-based drugs. Besides the use of organic fluorine as NMR label, fluoroalkyl groups can significantly improve structural and metabolic stability as well as the biological activity of peptides and peptidomimetics. Furthermore, such non- natural building blocks can be applied for the structural stabilization of proteins and for dictating their folding and oligomerization behavior. However, the applicability of fluorinated amino acids for the rational design of peptide-protein interaction sites is severely limited due to a lack of fundamental knowledge about the interaction properties of fluoroalkyl groups with native polypeptides, such as size, polarity, and the significance of fluorous interactions. In this thesis, a coiled coil-based model polypeptide with substitution sites for fluoroalkyl-substituted amino acids within specific hydrophobic and polar interfaces was designed to systematically investigate the interaction properties of fluoroalkyl groups in protein environments. Screening methods for the evaluation of size and polarity as well as for the characterization of fluorous interactions have been established. This screening system was sensitive enough to detect differences of a single fluorine atom between amino acid side chains. Systematically altered amino acids that vary in side chain length and fluorine content were incorporated into both interfaces of the model polypeptides via solid phase peptide synthesis and their influence on stability of the folding motif was evaluated. Based on thermostability measurements of the substituted coiled coils, opponent steric and electronic consequences of alkyl-fluorination on hydrophobic protein interactions were described. While an increase in side chain volume upon stepwise fluorine substitution stabilizes hydrophobic protein cores, a polarization of alkyl moieties in proximity to the fluorination site disturbs hydrophobic interactions. Coiled coil self- replication studies of revealed that fluorous interactions between substituted amino acids are strong enough to affect peptide and protein folding. Further investigations on Ca,a-dialkylated amino acids that are known to increase the metabolic stability of peptides, suggested that these building blocks can also improve the structural stability of coiled coil-based drugs. To select the best native binding partners for fluoroalklyl-substituted amino acids, the designed model polypeptide was adapted for library screening by phage display. A coiled coil-based stem loop peptide library was constructed and optimized regarding its size and diversity. Coiled coil formation and covalent linkage of the screening peptide to the library peptide were demonstrated on the surface of the soluble protein MBP. The display of the stem loop peptide on phage coat could also be shown. Since the specific binding of the screening peptide to the library peptide could not yet be accomplished on phage surface, library screenings were not performed in this work.
Fluorierte Aminosäuren stellen wertvolle Werkzeuge für die Entwicklung Peptid- basierter Wirkstoffe dar. Neben ihrem Einsatz als NMR-Sonde können Fluoralkylgruppen eingebaut werden, um die Bioverfügbarkeit und die pharmakokinetischen Eigenschaften von Peptiden und Peptidmimetika zu verbessern. Desweiteren können diese nicht-natürlichen Bausteine für die strukturelle Stabilisierung von Proteinen und zur Steuerung deren Faltung und Oligomerisierung genutzt werden. Die Anwendbarkeit fluorierter Aminosäuren für das rationale Design von Peptid-Protein-Interaktionsdomänen ist bisher jedoch stark limitiert. Ursache dafür ist der Mangel an grundlegendem Wissen über die Wechselwirkungs-eigenschaften von Fluoralkylgruppen mit nativen Polypeptiden, wie z. Bsp. Größe, Polarität, Fluor-Fluor-Wechselwirkungen und deren Bedeutung für Faltung und Stabilität. In der vorliegenden Arbeit wurde ein coiled coil- basiertes Modell-Polypeptid mit Substitut-ionspositionen für fluoralkyl- modifizierte Aminosäuren in spezifischen hydrophoben und polaren Wechselwirkungsdomänen etabliert, um die Wechselwirkungseigenschaften der Fluoralkylgruppen in Proteinumgebung systematisch zu studieren. Zur Charakterisierung dieser Eigenschaften wurden zwei Untersuchungsmethoden optimiert und angewendet. Das entwickelte screening-System war empfindlich genug um den Unterschied eines einzelnen Fluoratoms zwischen Aminosäure- Seitenketten zu detektieren. Aminosäuren mit systematisch variierten Seitenketten wurden mittels Festphasenpeptidsynthese in die Wechselwirkungsdomänen der Modell-Polypeptide eingebaut. Basierend auf Thermo- stabilitätsuntersuchungen der substituierten Peptide konnte gezeigt werden, dass eine Vergrößerung des Seitenkettenvolumens durch zunehmende Alkylfluorierung hydrophobe Protein-domänen stabilisiert. Eine Polarisierung von Alkylgruppen nahe der Fluorierungs-stelle stört dagegen hydrophobe Wechselwirkungen. Selbstreplikations-Studien zeigten, dass Fluor-Fluor- Wechselwirkungen stark genug sind, um die Faltung von Peptiden und Proteinen zu beeinflussen. Desweiteren konnte mithilfe des screening-Systems gezeigt werden, dass Ca,a-dialkylierte Aminosäuren die Strukturstabilität von coiled coil-basierten Peptidwirkstoffen erhöhen können. Um die bevorzugten Wechselwirkungspartner fluoralkyl-substituierter Aminosäuren zu ermitteln, wurde das Modell-Polypeptid für ein Phage-Display-basiertes Bibliotheks- screening verwendet. Größe und Diversität einer entsprechenden Peptidbibliothek wurden optimiert und die coiled coil-Bildung von screening- und Bibliothekspeptid konnte an der Oberfläche des löslichen Proteins MBP nachgewiesen werden. Der Einbau des Bibliothekspeptids in die Phagenhülle konnte ebenfalls realisiert werden. Da die coiled coil-Bildung an der Phagenoberfläche noch nicht verwirklicht werden konnte, wurden im Rahmen dieser Arbeit keine Bibliotheks-screenings durchgeführt.
