The role of dendritic filopodia in postembryonic remodelling of dendritic architecture

Abstract

This thesis was divided into two parts. In the first part I developed novel tools to generate precise geometric reconstructions of neuronal shapes from confocal image stacks. These can be done semi-automatically on complex branching neurons and can achieve a degree of precision not previously available at the corresponding respective optical resolution. The semi- automatic reconstruction methods are described in chapter 2.

I further established techniques for full automation of the reconstruction process. These can be applied on 'simple' neurons (such as cerebellar Purkinje cells) and still yield maximum precision, however they are restricted to clearly-stained neuronal branches. Furthermore, I developed methods to quantitatively investigate the distribution of labeled molecules (i.e. synaptic proteins, cell surface molecules etc.) along neuronal surfaces. Together, these new methods open up new frontiers in functional neuro-anatomy. One example is that synapse distributions through dendritic trees can be now estimated from light microscopy work. This work is presented in chapter 3.

In the second part of the thesis I used these novel methods to analyze the role of dendritic filopodia for postembryonic dendritic growth and for synaptogenesis of motorneurons during the metamorphosis of Manduca sexta. The results are described in chapter 4 and demonstrate that two different types of filopodia, namely shaft and tip filopodia, exist within one dendritic tree. Both undergo a different morphogenesis during ongoing dendritic growth and synaptogenesis. The data further indicate that shaft filopodia may mainly be important for guiding in axon terminals which have just made contact with dendritic filopodia, whereas the tip filopodia seem to have little to do with synaptogenesis, but are, on the other hand, important for steering growing dendrites through developing neuropils.

On the basis of the new methods and the results on dendrite development and synaptogenesis within developing dendritic trees, several future challenges can now be faced: First, one could employ the techniques to localize the sites of input synapses not only on filopodia but throughout entire dendritic trees. This might help to figure out the rules as to where and when synapses are formed during postembryonic remodelling. Second, such synapses localization analysis can be broken down according to the different transmitter types by combining transmitter and synaptic protein immuno-cytochemistry with precise neuronal surface reconstruction. And finally, the role of specific synapse distribution rules through dendritic trees for adult behavior can be addressed by theoretical computational analysis with multi-compartment modelling. Geometric reconstructions can be equipped with the sites of various different types of input synapses and exported into modelling software like NEURON. This allows us to compare random synapse distributions with those found in the tissue, and to compare rules for synapse distribution found at different developmental stages on different dendritic geometries. Since the function of the Motorneuron 5 in Manduca sexta is well understood at the larval and the adult stages, this yields the unique possibility to investigate the effects on dendritic shape and synapse distribution through this complex geometry in the light of neuronal function, and even in a behavioral context.

Diese Dissertation besteht aus zwei thematisch zusammenhängenden Teilen. Im ersten Teil beschreibe ich die Entwicklung von Methoden, die es erlauben, genaue geometrische Rekonstruktionen des Verzeigungsmusters anhand von Neuronen von 3-dimensionalen Bilderstapeln zu erstellen, die mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie aufgenommen wurden. Die Rekonstruktion erfolgt semi- automatisch und erzielt auch bei stark verzweigten Neuronen eine Genauigkeit, die die optische Auflösung des entsprechenden Mikroskopie-Verfahren voll ausnutzt. Eine derartige Genauigkeit wird von keinen anderen derzeit erhältlichen Rekonstruktionsmethoden erreicht. Diese Ergebnisse werden in Kapitel 2 beschrieben.

Im Kapitel 3 beschreibe ich die Erweiterung der semi-automatischen Rekonstruktions-Algorithmen, um eine vollständige Automatisierung der geometrischen Rekonstruktion ``einfach'' verzweigter Neuronen (zum Beispiel zerebrale Purkinje-Neurone) zu ermöglichen. Diese voll-automatischen Methoden sind auf deutlich gefärbte Strukturen beschränkt, welche jedoch dann ohne Einbußen in der Genauigkeit rekonstruiert werden. Desweiteren beschreibe ich Methoden, immun-histochemische Färbungen entlang der Oberfläche von Neuronen quantitativ zu erfassen (zum Beispiel synaptisch lokalisierte Proteine oder Zelloberflächen-Moleküle). Im Zusammenspiel ermöglichen diese Rekonstruktions- und Quantifizierungsmethoden, neuartige Fragestellungen in der funktionellen Neuroanatomie zu bearbeiten. Ein Beispiel ist die Analyse der Verteilung von putativen Eingangs-Synapsen auf gesamten dendritischen Neuronverzweigungen anhand lichtmikroskopischer Meßmethoden.

Im zweiten Teil meiner Arbeit benutze ich diese neuentwickelten Rekonstruktions-Methoden, um die Rolle von Filopodien entlang dendritischer Verzweigungen in Bezug auf Wachstumssteuerung und Synaptogenese zu untersuchen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung beschreibe ich in Kapitel 4. Ich konnte zeigen, daß zumindest zwei unterschiedliche Typen von dendritischen Filopodien innerhalb eines Dendritenbaumes vorkommen, nämlich solche an dendritischen Endigungen und Filopodien entlang dendritischer Schaft-Segmente. Beide Typen unterliegen einer entwicklungsabhängigen Morphogenese, die sich allerdings untereinander verglichen unterscheidet. Die Ergebnisse lassen auf unterschiedliche Aufgaben beider Typen von Filopodien schließen: Schaft- Filopodien übernehmen hauptsächlich die Aufgabe, präsynaptische Axon- Endigungen in Richtung Dendrit zu leiten. Filopodien an dendritischen Endigungen hingegen haben geringen Anteil an Synaptogenese, übernehmen jedoch hauptsächlich die Wachstums-Steuerung von Dendriten durch das sich entwickelnde Neuropil.

Diese Arbeit bereitet die Grundlage, anhand neu entwickelter Rekonstruktionsmethoden und der Ergebnisse zu Dendritenwachstum und Synaptogenese in sich entwickelnden dendritischen Bäumen weitere Fragestellungen zu bearbeiten. Zum einen können die Verteilungen von Synapsen auf kompletten dendritischen Feldern analysiert werden. Dies kann dazu beitragen, Regeln der zeitlichen und ortsabhängigen Synaptogenese auf sich entwickelnden Neuronen zu untersuchen. Synapsenorte können des weiteren auf ihre Transmitter-Spezifität hin unterschieden werden, indem man synaptisch lokalisierte Proteine und unterschiedliche Transmittertypen immuno- histochemisch markiert und deren räumliche Korrelation bestimmt.

Abschließend kann dann die Bedeutung von ermittelten Regeln der Synapsenverteilung für adultes Verhalten mittels Multi-Kompartiment-Modellen analysiert werden. Dazu werden geometrische Rekonstruktionen mit unterschiedlichen Synapsentypen ausgestattet und in Modellierungs-Programme wie zum Beispiel NEURON exportiert. So kann die funktionelle Bedeutung von zufällig verteilten Synapsen mit einer Synapsen-Verteilung verglichen werden, wie sie im Gewebe ermittelt worden ist. Auch ein Vergleich unterschiedlicher Regeln von Synapsenverteilungen während verschiedenen Entwicklungsstufen ist möglich. Da die unterschiedlichen Funktionen des Motorneuron 5 in Manduca sexta in Larven und adulten Motten gut bekannt sind, eignet sich dieses Neuron besonders, die Bedeutung von dendritischer Struktur und Synapsenverteilung in Bezug auf neuronale Funktion zu untersuchen oder sogar mit der Aufgabe im Verhaltenskontext zu korrelieren.