Die Integrität der Tight Junctions (TJs) sowie die Aufrechterhaltung der transepithelialen Barriere ist entscheidend für die Funktion epithelialer und endothelialer Zellschichten. TJs regulieren die Barriere für den parazellulären Transport, sichern die Polarität der Zellen und integrieren zahlreiche Signalwege. Das Tetraspan-Transmembranprotein Occludin ist eine der Hauptkomponenten dieser Zell-Zellverbindungen und spielt eine fundamentale Rolle bei der molekularen Organisation und Funktion der TJs. Neuere Erkenntnisse zeigen, dass Phosphorylierungen der TJ-Komponenten eine grundlegende Bedeutung bei der Regulation der TJs zukommt. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, Kinasen zu identifizieren, die Occludin phosphorylieren, die entsprechenden Phosphorylierungsstellen zu identifizieren und die Auswirkungen auf die TJs zu studieren. Zunächst konnte in Co- Immunpräzipitationsstudien gezeigt werden, dass die Kinasen CKI und CKII an Occludin binden. Diese Interaktion konnte über in vitro- Assoziationsexperimente anhand rekombinant exprimierter GST-Fusionsproteine der cytoplasmatischen Domänen von Occludin bestätigt werden. Anschließend wurden die Aminosäuren S25, S277, S302, T305, S313, S326, S327, S341 und T403 über in vitro-Phosphorylierung und massenspektrometrische Analysen als potentielle Phosphorylierungsstellen der CKI-abhängigen Phosphorylierung identifiziert. Durch Mutagenese dieser Aminosäuren und anschließende in vitro- Phosphorylierung konnte jedoch nicht bestätigt werden, dass es sich bei diesen Aminosäuren um physiologisch relevante Phosphorylierungsstellen handelt. Für CKII konnten dagegen die Aminosäuren T400, T404 und S408 als Phosphorylierungsstellen identifiziert werden. Aufeinanderfolgende Mutagenese dieser Aminosäuren und in vitro-Kinasierungsexperimente zeigte, dass der CKII- abhängigen Phosphorylierung ein sequentieller Mechanismus zugrunde liegt, bei dem die Phosphorylierung von S408 die Phosphorylierung an T400/T404 verstärkt. Zur funktionellen Charakterisierung der CKII-abhängigen Phosphorylierung wurden jeweils eine phosphorylierungsdefiziente T400A/T404A/S408A- sowie eine phosphomimetische T400E/T404E/S408E-Mutation generiert und diese auf Bindung zu den Zonula occludens-Proteinen untersucht. Über in vitro- Assoziationsexperimente und Co-Immunpräzipitationsexperimente konnte kein Einfluss der Phosphorylierungsstellen auf die Bindung zu ZO-1 festgestellt werden, während die T400E/T404E/S408E-Mutation die Bindung zu ZO-2 destabilisiert. Zur Untersuchung der physiologischen Bedeutung der CKII- abhängigen Phosphorylierung wurden MDCK C11-Zellen stabil mit der T400A/T404A/S408A- sowie der T400E/T404E/S408E-Mutante transfiziert. Konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie zeigte, dass die Lokalisation der Konstrukte nicht von der Mutation der CKII-Phosphorylierungsstellen abhängt. Über Ca2+-Switch- Experimenten konnte jedoch für die T400E/T404E/S408E-Mutante eine Verzögerung der Assemblierung der TJs festgestellt werden. Zusätzlich konnte in 2-Wege Impedanzmessungen nachgewiesen werden, dass diese Mutation zu einer Erhöhung des parazellulären Widerstandes führt. Zusammenfassend lässt sich vermuten, dass durch die CKII-abhängige Phosphorylierung die Interaktion von Occludin mit den ZO-Proteinen moduliert und die Barrierefunktion der TJs beeinflusst werden kann.
The integrity of the Tight Junctions (TJs), as well as the maintenance of the transepithelial barrier is critical to the function of epithelial and endothelial cell sheets. Besides regulating the barrier for the paracellular transport, TJs constitute to the polarity of the cells and integrate various signaling pathways. The tetraspan transmembrane protein Occludin is one of the main components within these cell-cell-contact sites and plays a fundamental role in the molecular organization and function of the TJs. In addition recent studies revealed that phosphorylation events critically regulate the TJs. Therefore, the aim of this study was to detect kinases that act on occludin, to identify the phosphorylation sites and to study the physiological consequences of these phosphorylations. Using a co-immunprecipitation assay it was shown that the kinases CKI and CKII bind to occludin. The direct interaction was confirmed in a pull-down assay with recombinant expressed GST- fusion proteins of the cytoplasmic domains of occludin. In vitro phosphorylation followed by MALDI/TOF analysis identified the aminoacids S25, S277, S302, T305, S313, S326, S327, S341 and T403 as potential CKI phosphorylation sites. Unfortunately, using site-directed mutagenesis and subsequent in vitro phosphorylation, none of these residues could be finally confirmed as specific CKI phosphosites. In constrats, the aminoacids T400, T404 and S408 have been identified as exclusive CKII phosphorylation sites. Successive mutagenesis and in vitro kinase assays revealed a sequential phosphorylation process in which the phosphorylation of S408 elevates the phosphorylation level of T400/T404. To study the impact of the CKII-dependent phosphorylation on binding of occludin to ZO-proteins, a phosphorylation- deficient T400A/T404A/S408A- as well as a phosphomimetic T400E/T404E/S408E- occludin mutant was generated. In vitro association assays and Co-IP suggest that the phosphorylation of these residues significantly destabilizes the interaction between occludin and ZO-2, whereas the ZO-1-occludin interaction is unaffected. Concerning the physiological effects of the CKII-dependent phosphorylation, MDCK C11 cells, stably expressing the occludin wt and mutant constructs, were generated. Confocal immunfluorescence showed that the localization of the occludin constructs was not changed within the different clones. In contrast, during calcium induced assembly of the TJs, the insertion of the occludin T400E/T404E/S408E mutant into the intercellular junctions appeared to be delayed in comparison to wt-occludin. Moreover, the transepithelial resistance of MDCK C11 cells as measured by two-path impedance spectroscopy is increased when T400/T404/S408 was mutated to alanine. Taken together, these data suggests that phosphorylation of occludin by CKII alters binding to ZO-proteins and in consequence modulates TJ function.
