dc.contributor.author
Dörfel, Max
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:16:11Z
dc.date.available
2012-06-21T06:20:37.065Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/7639
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-11838
dc.description
1\. EINLEITUNG 1 1.1 Tight Junctions (TJ) 4 1.1.1. Junctional Adhesion
Molecule (JAM) 5 1.1.2. Die Claudin-Proteinfamilie 6 1.1.3. Die Zonula
occludens Proteine (ZO-Proteine) 6 1.1.4. Tricellulin 7 1.2 Occludin 7 1.2.1.
Die Funktion von Occludin 8 1.2.2. Phosphorylierung von Occludin 9 1.2.3.
Phosphorylierung von Occludin durch CKI und CKII 11 1.3 Zielsetzung 12 2\.
MATERIALIEN 14 2.1 Chemikalien 14 2.2 Verbrauchsmaterialien 15 2.3
Molekularbiologische Materialien 16 2.3.1. cDNAs 16 2.3.2. Expressionsvektoren
16 2.3.3. Oligonukleotide und Primer 17 2.3.4. Bakterienstämme 19 2.4
Proteinbiochemische Materialien 19 2.4.1. Molekulargewichtsstandards 19 2.4.2.
Antikörper 19 2.4.3. Enzyme 21 2.5 Zellkultur 21 2.5.1. Medien und Lösungen 21
2.5.2. Eukaryontische Zelllinien 21 2.6 Reaktionskits 22 2.7 Geräte 22 2.7.1.
Zentrifugen 22 2.7.2. Elektrophorese und Western Blot 22 2.7.3. Bakterien und
Zellkultur 23 2.7.4. Sonstige Geräte 23 3\. METHODEN 24 3.1
Molekularbiologische Methoden 24 3.1.1. PCR zur Amplifizierung von Konstrukten
24 3.1.2. Elektrophoretische Auftrennung von DNA 24 3.1.3. Reinigung von DNA
aus Agarosegelen 25 3.1.4. Verdau von DNA durch Typ II
Restriktionsendonukleasen 25 3.1.5. Phenol-Chloroform-Extraktion 25 3.1.6.
Ethanolfällung von DNA 26 3.1.7. Phosphorylierung von Oligonukleotiden 26
3.1.8. Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten 26 3.1.9. Ligation von DNA-
Fragmenten in Vektoren 27 3.1.10. Hitzeschock-Transformation in kompetente E.
coli-Zellen 27 3.1.11. Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli 28 3.1.12. DNA-
Sequenzierung 28 3.1.13. Ortspezifische Mutagenese 29 3.2 Proteinbiochemische
Methoden 30 3.2.1. Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen 30 3.2.2.
Proteinfärbung in SDS-Polyacrylamidgelen mit Coomassie Brilliant Blue 31
3.2.3. Silberfärbung von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen 31 3.2.4.
Elektrotransfer von Proteinen auf PVDF-Membranen 32 3.2.5. Immunologischer
Nachweis von Proteinen auf PVDF-Membranen 33 3.2.6. Proteinbestimmung: BCA-
Assay 33 3.2.7. Rekombinante Expression von Fusionsproteinen in E. coli 33
3.2.7.1. GST- und MBP-getaggte Proteine 35 3.2.7.2. His6-getaggte Proteine
(nativ) 35 3.2.8. Dialyse von Proteinlösungen 35 3.2.9. In vitro-Assoziation
von MBP- und GST-Fusionsproteinen (Pull-Down-Assay) 36 3.2.9.1. Interaktion
von Occludin mit CKI und CKII 36 3.2.9.2. Interaktion von Occludin mit ZO-2 in
MDCK-Zelllysaten 37 3.2.9.3. Interaktion von Occludin mit ZO-1 37 3.2.10. Co-
Immunpräzipitation (IP) 37 3.2.10.1. Nachweis von Occludin-Casein-Kinase-
Komplexen in HEK-293-Zelllysaten 38 3.2.10.2. Nachweis von Occludin-
ZO-2-Komplexen in MDCK-Zelllysaten 38 3.2.11. In vitro-Phosphorylierung 38 3.3
Zellkultur 39 3.3.1. Kultivierung von Zellen 39 3.3.2. Bestimmung der Zellzahl
in einer Neubauer-Zählkammer 40 3.3.3. Einfrieren von Zellen 40 3.3.4.
Auftauen von Zellen 40 3.3.5. Transiente Transfektion von Zellen 41 3.3.5.1.
Calciumphosphat-Transfektion 41 3.3.5.2. Transfektion mit Fugene®HD 41
3.3.5.3. Transfektion mit TurboFect™ 41 3.3.6. Stabile Transfektion von Zellen
42 3.3.7. Lyse eukaryotischer Zellen 42 3.3.8. Indirekte Immunfluoreszenz 43
3.3.9. Calcium-Switch-Experimente 43 3.3.10. Widerstandsmessungen 44 3.3.11.
Proliferationsassay 45 3.3.12. MALDI 46 4\. ERGEBNISSE 47 4.1 Interaktion von
Occludin mit Kinasen 47 4.1.1. Interaktion von Occludin mit CKI und CKII 47
4.1.2. Direkte Interaktion von Occludin mit CKI und CKII 48 4.2
Phosphorylierung von Occludin 50 4.2.1. Identifizierung von CKI-
Phosphorylierungsstellen 51 4.2.2. Identifizierung von CKII-
Phosphorylierungsstellen in Occludin 53 4.2.3. Serielle Phosphorylierung durch
GSK3β 55 4.3 CKII-abhängige Interaktion von Occludin mit ZO-1 und -2 57 4.3.1.
Direkte Interaktion von Occludin und ZO-1 57 4.3.2. Charakterisierung der
Occludin-ZO-2-Interaktion in MDCK-Zellen 59 4.4 Physiologische Bedeutung der
CKII-abhängigen Phosphorylierung 61 4.4.1. Einfluss der CKII-abhängigen
Phosphorylierung auf die Assemblierung der TJs 63 4.4.2. Einfluss der CKII-
abhängigen Phosphorylierung auf die Barriereeigenschaften der TJs 65 4.4.3.
Einfluss der CKII-abhängigen Phosphorylierung auf Proliferation 67 5\.
DISKUSSION 68 5.1 Occludin interagiert mit den Kinasen CKI und CKII 68 5.2 CKI
phosphoryliert Occludin 69 5.3 CKII phosphoryliert Occludin an den Aminosäuren
T400, T404 und S408 70 5.4 Phosphorylierung von Occludin durch GSK3β 71 5.5
Die CKII-abhängige Phosphorylierung von Occludin moduliert die Interaktion
zwischen Occludin und den ZO-Proteinen 72 5.5.1. Interaktion von Occludin und
ZO-2 73 5.5.2. Interaktion von Occludin und ZO-1 73 5.6 Die physiologische
Bedeutung der CKII-abhängigen Phosphorylierung von Occludin 74 5.6.1.
Lokalisation der Occludin-Konstrukte 74 5.6.2. Dissoziation und
Reassemblierung der Tight Junctions 75 5.6.3. Transepithelialer Widerstand 76
5.6.4. Proliferation 78 6\. ZUSAMMENFASSUNG 80 7\. SUMMARY 82 8\. LITERATUR 84
9\. ANHANG 94
dc.description.abstract
Die Integrität der Tight Junctions (TJs) sowie die Aufrechterhaltung der
transepithelialen Barriere ist entscheidend für die Funktion epithelialer und
endothelialer Zellschichten. TJs regulieren die Barriere für den
parazellulären Transport, sichern die Polarität der Zellen und integrieren
zahlreiche Signalwege. Das Tetraspan-Transmembranprotein Occludin ist eine der
Hauptkomponenten dieser Zell-Zellverbindungen und spielt eine fundamentale
Rolle bei der molekularen Organisation und Funktion der TJs. Neuere
Erkenntnisse zeigen, dass Phosphorylierungen der TJ-Komponenten eine
grundlegende Bedeutung bei der Regulation der TJs zukommt. Daher war es das
Ziel dieser Arbeit, Kinasen zu identifizieren, die Occludin phosphorylieren,
die entsprechenden Phosphorylierungsstellen zu identifizieren und die
Auswirkungen auf die TJs zu studieren. Zunächst konnte in Co-
Immunpräzipitationsstudien gezeigt werden, dass die Kinasen CKI und CKII an
Occludin binden. Diese Interaktion konnte über in vitro-
Assoziationsexperimente anhand rekombinant exprimierter GST-Fusionsproteine
der cytoplasmatischen Domänen von Occludin bestätigt werden. Anschließend
wurden die Aminosäuren S25, S277, S302, T305, S313, S326, S327, S341 und T403
über in vitro-Phosphorylierung und massenspektrometrische Analysen als
potentielle Phosphorylierungsstellen der CKI-abhängigen Phosphorylierung
identifiziert. Durch Mutagenese dieser Aminosäuren und anschließende in vitro-
Phosphorylierung konnte jedoch nicht bestätigt werden, dass es sich bei diesen
Aminosäuren um physiologisch relevante Phosphorylierungsstellen handelt. Für
CKII konnten dagegen die Aminosäuren T400, T404 und S408 als
Phosphorylierungsstellen identifiziert werden. Aufeinanderfolgende Mutagenese
dieser Aminosäuren und in vitro-Kinasierungsexperimente zeigte, dass der CKII-
abhängigen Phosphorylierung ein sequentieller Mechanismus zugrunde liegt, bei
dem die Phosphorylierung von S408 die Phosphorylierung an T400/T404 verstärkt.
Zur funktionellen Charakterisierung der CKII-abhängigen Phosphorylierung
wurden jeweils eine phosphorylierungsdefiziente T400A/T404A/S408A- sowie eine
phosphomimetische T400E/T404E/S408E-Mutation generiert und diese auf Bindung
zu den Zonula occludens-Proteinen untersucht. Über in vitro-
Assoziationsexperimente und Co-Immunpräzipitationsexperimente konnte kein
Einfluss der Phosphorylierungsstellen auf die Bindung zu ZO-1 festgestellt
werden, während die T400E/T404E/S408E-Mutation die Bindung zu ZO-2
destabilisiert. Zur Untersuchung der physiologischen Bedeutung der CKII-
abhängigen Phosphorylierung wurden MDCK C11-Zellen stabil mit der
T400A/T404A/S408A- sowie der T400E/T404E/S408E-Mutante transfiziert. Konfokale
Immunfluoreszenzmikroskopie zeigte, dass die Lokalisation der Konstrukte nicht
von der Mutation der CKII-Phosphorylierungsstellen abhängt. Über Ca2+-Switch-
Experimenten konnte jedoch für die T400E/T404E/S408E-Mutante eine Verzögerung
der Assemblierung der TJs festgestellt werden. Zusätzlich konnte in 2-Wege
Impedanzmessungen nachgewiesen werden, dass diese Mutation zu einer Erhöhung
des parazellulären Widerstandes führt. Zusammenfassend lässt sich vermuten,
dass durch die CKII-abhängige Phosphorylierung die Interaktion von Occludin
mit den ZO-Proteinen moduliert und die Barrierefunktion der TJs beeinflusst
werden kann.
de
dc.description.abstract
The integrity of the Tight Junctions (TJs), as well as the maintenance of the
transepithelial barrier is critical to the function of epithelial and
endothelial cell sheets. Besides regulating the barrier for the paracellular
transport, TJs constitute to the polarity of the cells and integrate various
signaling pathways. The tetraspan transmembrane protein Occludin is one of the
main components within these cell-cell-contact sites and plays a fundamental
role in the molecular organization and function of the TJs. In addition recent
studies revealed that phosphorylation events critically regulate the TJs.
Therefore, the aim of this study was to detect kinases that act on occludin,
to identify the phosphorylation sites and to study the physiological
consequences of these phosphorylations. Using a co-immunprecipitation assay it
was shown that the kinases CKI and CKII bind to occludin. The direct
interaction was confirmed in a pull-down assay with recombinant expressed GST-
fusion proteins of the cytoplasmic domains of occludin. In vitro
phosphorylation followed by MALDI/TOF analysis identified the aminoacids S25,
S277, S302, T305, S313, S326, S327, S341 and T403 as potential CKI
phosphorylation sites. Unfortunately, using site-directed mutagenesis and
subsequent in vitro phosphorylation, none of these residues could be finally
confirmed as specific CKI phosphosites. In constrats, the aminoacids T400,
T404 and S408 have been identified as exclusive CKII phosphorylation sites.
Successive mutagenesis and in vitro kinase assays revealed a sequential
phosphorylation process in which the phosphorylation of S408 elevates the
phosphorylation level of T400/T404. To study the impact of the CKII-dependent
phosphorylation on binding of occludin to ZO-proteins, a phosphorylation-
deficient T400A/T404A/S408A- as well as a phosphomimetic T400E/T404E/S408E-
occludin mutant was generated. In vitro association assays and Co-IP suggest
that the phosphorylation of these residues significantly destabilizes the
interaction between occludin and ZO-2, whereas the ZO-1-occludin interaction
is unaffected. Concerning the physiological effects of the CKII-dependent
phosphorylation, MDCK C11 cells, stably expressing the occludin wt and mutant
constructs, were generated. Confocal immunfluorescence showed that the
localization of the occludin constructs was not changed within the different
clones. In contrast, during calcium induced assembly of the TJs, the insertion
of the occludin T400E/T404E/S408E mutant into the intercellular junctions
appeared to be delayed in comparison to wt-occludin. Moreover, the
transepithelial resistance of MDCK C11 cells as measured by two-path impedance
spectroscopy is increased when T400/T404/S408 was mutated to alanine. Taken
together, these data suggests that phosphorylation of occludin by CKII alters
binding to ZO-proteins and in consequence modulates TJ function.
en
dc.format.extent
VIII, 99 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Tight Junction
dc.subject
Phosphorylierung
dc.subject
Casein Kinasen
dc.subject
zonula occludens
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Der Einfluss posttranslationaler Modifikationen auf die Funktion des Tight
Junction-Proteins Occludin
dc.contributor.contact
max.doerfel@charite.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Otmar Huber
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Petra Knaus
dc.date.accepted
2010-06-21
dc.date.embargoEnd
2012-06-20
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000018104-7
dc.title.translated
The impact of posttranslational modifications on the function of the tight
junction protein occludin
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000018104
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000007845
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access