cGMP signalling regulates S-palmitoylation in sensory neurons

Abstract

During the development of the vertebrate nervous system, neurons from the central and the peripheral nervous systems generate an axon which navigates through the tissues. In many cases it might innervate multiple target regions by forming branches and by this build a complex and well-ordered network. Impairment of the formation of the neuronal network often leads to neurological disorders like schizophrenia. Thus, understanding the molecular mechanisms behind the different axonal branching events is of critical importance. In this work, I focused on a cGMP signalling cascade that regulates the dorsal root ganglion (DRG) and the cranial sensory ganglion (CSG) axon bifurcation, a specific form of axonal branching, in the mouse. This signalling cascade is composed of the ligand C-type natriuretic peptide (CNP), the natriuretic peptide receptor 2 (Npr2) and the cGMP-dependent kinase I subunit α (cGKIα). Each component was shown to be essential in the process of bifurcation of DRG and CSG axons entering the developing mouse spinal cord and hindbrain, respectively, using genetic approaches. However, downstream events triggered by cGKI that are involved in the sensory axon bifurcation are so far unknown. Moreover, direct biochemical and molecular approaches to find out cGKI substrate proteins resulted in a number of false-positive components that couldn´t be confirmed by genetic methods to be involved in sensory axon bifurcation in vivo. Thus, the principal aim of this work was to reconsider other approaches to characterize events taking place downstream of cGKI in sensory neurons that could help understand mechanisms that are triggered in vivo when DRG axons bifurcate. Using cell culture approaches, initially, I characterized the effects of CNP or a cGMP analogue on cultured embryonic DRG neurons and the F11 cell line. Importantly, one of the observed phenotypes was that the CNP-Npr2-cGKI signalling pathway triggered a growth cone remodelling leading to its enlargement. In addition to that, study on the localization of cGKI in cultured embryonic mouse DRG neurons using immunocytochemistry and click chemistry revealed its omnipresence close to intracellular membranes of the central domain of the growth cone. This region of the growth cone was found to be enriched in palmitoylated proteins suggesting a regulation of protein trafficking via S-palmitoylation by cGKI that would lead to a remodelling of the growth cone. Furthermore, cell culture approaches demonstrated the essential role of S-palmitoylation in the Npr2-mediated DRG growth cone remodelling downstream of cGKI pinpointing its possible regulation by this signalling pathway. Moreover, a biochemical approach revealed that cGMP signalling regulates S-palmitoylation in DRG-like F11 cells supporting this idea. Altogether, this study shed the light on an interplay between cGKI- mediated phosphorylation and the regulation of S-palmitoylation and its central role in Npr2-mediated cGMP signalling in vitro and possibly in vivo. In parallel to this, the focal adhesion kinase (FAK)-mediated axon guidance was investigated. Its absence in mouse DRG neurons in vivo induced an overshooting of some of their axons entering the spinal cord. This study described FAK as playing a central role in the guidance of a proprioceptive and nociceptive subpopulation of DRG axons entering the developing mouse spinal cord in a cell-autonomous manner.

Während der Entwicklung des Vertebraten Nervensystems erzeugen Neurone aus dem zentralen und peripheren Nervensystem ein Axon, das durch den Wachstumskegel navigiert und Zielregionen innerviert, indem es neue Äste bildet. Somit entsteht ein komplexes und gut geordnetes Netzwerk. Eine Beeinträchtigung der Bildung des neuronalen Netzes führt oft zu neurologischen Störungen wie zum Beispiel Schizophrenie. So ist das Verständnis der molekularen Mechanismen, die zu Bildung von Axonverzweigung führen, von großer Bedeutung. In dieser Arbeit konzentrierte ich mich auf eine intrazelluläre cGMP-Signalkaskade, die die Bifurkation, eine spezifische Form der Verzweigung, von Axonen der Spinalganglien (DRG) und kranialen sensorischen Ganglien (CSG) reguliert. Diese Signalkaskade besteht aus dem Liganden CNP (natriuretisches Peptid Typ C), dem Rezeptor Npr2 (natriuretischen Peptidrezeptor 2) und der Kinase cGKIα (cGMP-abhängigen Kinase Iα). Für jede Komponente wurde unter Verwendung genetischer Ansätze gezeigt, dass die Signalkaskade bei der Bifurkation von DRG- und CSG-Axonen benötigt wird, wenn diese in das Rückenmark und das Hinterhirn einwachsen. Allerdings sind nachgeschaltete Ereignisse, die durch die cGKI ausgelöst werden und an der sensorischen axonalen Bifurkation beteiligt sind, bislang unbekannt. Darüber hinaus konnten bislang keine relevanten cGKI-Substratproteine, die an diesem Bifurkationsprozess beteiligt sind, durch direkte biochemische und molekulare Ansätze identifiziert werden. Das Hauptziel dieser Arbeit war es also, andere Ansätze zu entwickeln, um Ereignisse zu charakterisieren, die stromabwärts von der cGKI in den sensorischen Neuronen stattfinden, damit DRG-Axone bifurkieren. Mit Zellkulturansätzen charakterisierte ich zunächst die Wirkung von CNP oder einem cGMP Analogen auf kultivierte embryonale DRG-Neuronen und F11 Zellen. Interessanterweise war eines der beobachteten Phänomene die Vergrößerung des Wachstumskegels ausgelöst durch die CNP-Npr2-cGKI-Signalkaskade. Darüber hinaus zeigten Lokalisierungsstudien von der cGKI in den kultivierten embryonalen Maus-DRG-Neuronen mittels Immunzytochemie und der „click chemistry“ eine Lokalisierung der cGKI an den intrazellulären Membranen und am stärksten in der zentralen Domäne (ZD) des Wachstumskegels. Die ZD zeigte eine Omnipräsenz von palmitoylierten Proteinen. Somit könnte die cGKI über S-Palmitoylierung den intrazellulären Transport von Proteinen zur Wachstumskegel-Plasmamembran modulieren. Interessanterweise zeigten Zellkulturansätze eine zentrale Rolle der S-Palmitoylierung in der Npr2-vermittelten Umgestaltung des DRG-Wachstumskegels. Außerdem zeigte ein biochemischer Ansatz, dass die cGMP-vermittelte Signaltransduktion die S-Palmitoylierung in F11 Zellen reguliert. Zusammengefasst habe ich in dieser Studie ein Zusammenspiel zwischen der cGKI-vermittelten Phosphorylierung und der Regulation der S-Palmitoylierung und ihre Funktion bei der Npr2-vermittelten cGMP-Signalkaskade in vitro und möglicherweise in vivo untersucht. Zusätzlich habe ich die fokale Adhäsionskinase (FAK)-vermittelte axonalen Lenkung untersucht. Die Abwesenheit von FAK in Maus-DRG-Neuronen induzierte ein Überschießen von einigen Axonen, die in das Rückenmark einwachsen. In dieser Studie beschreibe ich die FAK als einen zentralen Faktor bei der Lenkung einer Subpopulation von propriozeptiven und nozizeptiven DRG- Axonen, die in das sich entwickelnde Maus-Rückenmark in einer Zell-autonomen Weise einwachsen.