Der Gewebe-Typ Plasminogenaktivator (tPA) ist eine Serinprotease, der neben seiner bekannten Rolle im fibrinolytischen System auch als wichtiger Mediator von kognitiven Prozessen erkannt worden ist. Ein Verständnis der Rolle von tPA in der Regulation der neuronalen Plastizität (z. B. der Remodellierung von Synapsen), der neuronalen Degeneration und der Erinnerungsbildung (long-term potentiation) erfordert die Untersuchung der Genregulation im Nervengewebe. Diesbezüglich liegen bis dato nur wenige in vitro Daten und keinerlei in vivo Daten vor. Neurotrophine regulieren die Expression von tPA in Abhängigkeit von Zeit und Dosis. Eine 2,4-2,5fache EC50 induzierte bei NGF (Nerve Growth Factor, 100 ng/ml) nach 48 h einen 4fachen steady-state Level der mRNA Expression, während die Neurotrophine BDNF (Brain Derived Neutrophic Factor, 5 ng/ml) und NT-4 (Neurotrophin 4, 25 ng/ml) hingegen schon jeweils nach 4 h ein um ~5fach erhöhtes Expressionsniveau induzierten, das nach etwa 8 h wieder auf den ursprünglichen Wert absank. NT-3 (Neurotrophin 3, 5 ng/ml) zeigte keinerlei Effekte. Die beobachteten Induktionseffekte waren unabhängig von einer de novo Proteinsynthese und nicht auf eine Veränderungen in der mRNA Stabilität zurückzuführen. Eine für die Stimulation der Transkription verantwortliche Promotorregion konnte in Transaktivierungsassays nicht identifiziert werden. Die in vivo Untersuchung des tPA-Gens in den Neuroblastom-Zelllinien (SK-N-SH, SNB-19, KELLY) zeigte DNaseI hypersensitive Bereiche im Promotor (bis zu ?3.6 kb, bis zu ?5.3 kb untersucht), dem ersten und dem dritten Intron. Die detaillierte Untersuchung der DNaseI hypersensitiven Bereiche im Promotor mittels der in vivo Footprinting-Analyse ergab 46 geschützte responsive DNA-Bereiche, die mit 28 bekannten Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren (Sequenzähnlichkeit >90 %) korrespondieren. Des weiteren wurden 27 geschützte DNA-Regionen von wenigen Basen Länge identifiziert, die mit keinen bekannten Bindungsstellen korrelieren (Sequenzähnlichkeit >90 %). Viele der identifizierten cis-aktiven DNA-Elemente (z. B. AP1, SP1, NFAT, NF-?B etc.) sind bereits in einen Kontext mit Differenzierungsprozessen gestellt worden und stützen die publizierten Befunde einer Mitwirkung von tPA an diesen Vorgängen. Eine fast perfekte NF-?B Erkennungssequenz (91-100 % Sequenzidentität zu den NF-?B/Rel-Familie Erkennungssequenzen) ~3,1 kb oberhalb des Transkriptionsstarts wurde in Reportergenvektoren kloniert, mutiert und als Enhancer der tPA Transkription identifiziert. Sie ist verantwortlich für eine 11-13fache Induktion durch Phorbolester (PMA) im neuronalen Gewebe.
Tissue-type plasminogen activator (tPA) is a serine protease which catalyzes the conversion of plasminogen to plasmin within the fibrinolytic pathway to aid with blood clot dissolution. As a protease it is also necessary for processes in development (e. g. embryogenesis) and in cellular migration such as tumor outgrowth and metastasis. Recent studies have implicated tPA in neuronal plasticity, synaptic remodelling and neuronal degeneration. TPA is widely expressed in the CNS and neuronal aktivity induces the expression of mRNA of tPA in pyramidal neurons. Transgenic mice overexpressing tPA show an increased and prolonged hippocampal long-term potentiation (LTP) and improved performance in spatial orientation learning tasks while tPA-/- mutants exhibit learning deficits, retarded neuronal migration and resistance towards neuronal destruction by injections of excitotoxins. In MS brain tPA is thought to be responsible for the final enzyme-mediated process of demyelination. A better untestanding of the role of tPA in cognitive processes requires detailed examination of its regulation. No in vivo data and only few in vitro data could be gained regarding the control of neuronal expression of tPA until the beginning of this thesis.. In neuronal cells (SY5Y, SK-N-SH) neurotrophins induced the expression of mRNA of tPA in a dose and time dependent manner as shown by Ribonuclease Protection Assays (RPA) and Transactivation Assays. At 2.4 to 2.5 EC50 NGF (100 ng/ml) stimulated tPA expression 4fold after 48 h whereas BDNF (5 ng/ml) and NT-4 (25 ng/ml) stimulatd tPA expression ~5fold after 4 h. NT-3 (5 ng/ml) showed no effect at all. Neither of these effects was based on enhanced mRNA stability nor dependent of de novo protein synthesis. In vivo genomic analysis of the whole tPA gene in neuronal tissue (Kelly, SNB-19, SK-N-SH) exhibited DNaseI HS sites in the promotor region, 1st and 3rd intron. This promotor region was of further interest for this thesis. DNaseI HS sites spanning a region of ~3.6 kb in the promotor were investigated by in vivo footprinting and revealed 46 protected responsive sites towards 28 known transcription factors and 27 protected DNA elements of unknown protein factors (all based on matrix and core similarity >90%). Many of these factors are known to play roles in processes of development. One NF-?B responsive element at ~3.1 kb upstream of the transcription start site was further investigated. It bears an almost perfect consensus sequence for the NF-?B/Rel family of protein factors (91-100 % similarity) and shows enhancer properties in Transactivation Assays. Cloning into reporter-gene-vectors and site directed mutagenesis identified this element as being responsible for a very strong response to phorbolester (PMA) of 11-13 fold overnight in neuronal cells.
