Das stimulatorische Guaninnukleotid-bindende Protein (Gs) überträgt Signale von Gs-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) zu Adenylylcyclasen und erhöht dadurch die Produktion des second messengers cAMP. In Geweben von Säugerorganismen werden vier Spleißvarianten der α-Untereinheit von Gs (Gαs) exprimiert. Die einzelnen Spleißvarianten sind in zahlreichen Untersuchungen charakterisiert worden, jedoch sind die Ergebnisse wegen unterschiedlicher Messparameter und -systeme weder einheitlich noch vergleichbar. Für heterolog exprimierte, aufgereinigte Spleißvarianten wurden Unterschiede in den biochemischen Eigenschaften beschrieben, aber es ist nicht bekannt, ob diese Unterschiede über die gesamte Signalkaskade verstärkt oder abgeschwächt werden. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die Effektivität der Signaltransduktion über die vier Formen des Gαs anhand variantenspezifischer Repression (knock down) oder durch Rekonstitution unmodifizierter Spleißvarianten in Gαs-defizienten Zellinien verglichen. Mehrere Methoden zur transienten Repression wurden mit Hilfe eines Luziferase-Reportersystems verglichen. Katalytisch aktive DNA (DNAzym) war wegen der geringen Aktivität bei physiologischen Magnesiumkonzentrationen ungeeignet. Dagegen wurde eine bis zu 90 %ige Inhibition der Luziferase-Expression durch die Verwendung von Propin- modifizierten Oligodeoxynukleotiden oder durch intrazelluläre Expression von small interfering RNA erreicht. Aufgrund ihrer größeren Flexibilität bei der Wahl der Zielsequenz wurden Propin-modifizierte Oligodeoxynukleotide zur Repression von Gαs ausgewählt. Sie verminderten die Expression von transient transfiziertem, aber nicht von endogenem Gαs. In Sf9-Insektenzellen wurden Gαs-Spleißvarianten mit unterschiedlichen GPCR koexprimiert. Die Wechselwirkung zwischen GPCR und Gαs wurde mit Hilfe von ligandenabhängigen Bindungskinetiken des GTP-Analogs [35S]GTPγS an Plasmamembranen analysiert. Die Spleißvarianten wurden mit vergleichbaren Nukleotid-Bindungskonstanten durch die β2-adrenergen, Glucagon-, Histamin- und Secretin-Rezeptoren aktiviert (kapp ≈ 0,1 min-1). In der Gαs-defizienten Maus-Fibroblastenzellinie 2B2 wurde die Signaltransduktionskaskade GPCR Gαs Adenylylcyclase durch transiente Expression der Gαs Spleißvarianten rekonstituiert und auf der Ebene der Adenylylcyclase untersucht. Die Interaktion der Spleißvarianten mit der Adenylylcyclase wurde durch direkte Aktivierung des G-Proteins in Plasmamembranen verglichen. Die vier Spleißvarianten aktivierten die Adenylylcyclase mit halbmaximal wirksamen Konzentrationen von 0,24-0,31 nM und waren vergleichbar effizient. Weil diese Werte äquivalent waren, konnte die Adenylylcyclase-Aktivität als Maß für die Interaktion zwischen GPCR und Gαs verwendet werden. Die Spleißvarianten waren vergleichbar potent in der Adenylylcyclase-Aktivierung durch β2-adrenergen, Glucagon-, Histamin-, Secretin-, Vasopressin- und Luteinisierungshormon-Rezeptor. Zusammenfassend zeigte diese Arbeit, dass sich die Gαs-Spleißvarianten in der GPCR- vermittelten Adenylylcyclase-Aktivierung vergleichbar verhalten. Daher muss der Grund für die Expression der vier Spleißvarianten noch gefunden werden; die bisher wenig untersuchten Interaktionen mit weiteren Signalmolekülen, wie Tubulin oder den Src-Kinasen, werden diskutiert.
The stimulatory guanine nucleotide-binding protein (Gs) transmits signals from stimulatory G protein-coupled receptors (GPCR) to adenylyl cyclases, thereby increasing the production of the second messenger cAMP. Four splice variants of the α-subunit of Gs (Gαs) are expressed in mammalian tissues. Numerous studies have analysed their function, but due to differing experimental parameters and systems, the results were neither consistent nor comparable. Differences in the biochemical properties of heterologously expressed, purified splice variants have been described, but it is not known whether they are enhanced or weakened by transmission through the full signalling cascade. Therefore, the effectiveness of signal transduction via the four splice variants was compared using specific repression (knock down) or reconstitution of unmodified proteins in Gαs-deficient cell lines. Several methods of transient repression were compared using a luciferase reporter system. Catalytically active DNA (DNAzyme) was unsuitable because of its low activity at physiological magnesium concentrations. In contrast, up to 90 % inhibition of luciferase expression was achieved by either propyne-modified oligodeoxynucleotides or intracellular expression of small interfering RNA. The propyne-modified oligodeoxynucleotides were chosen for inhibition of Gαs on account of their greater flexibility in the choice of target sequences. They inhibited expression of transiently transfected but not of endogenous Gαs. In Sf9 insect cells, Gαs splice variants were co-expressed with various GPCR. The interaction between GPCR and Gαs in plasma membranes was compared by measuring ligand-dependent binding kinetics of the GTP analogue [35S]GTPγS. The four splice variants were activated with comparable apparent rate constants by the β2-adrenergic, glucagon, histamine and secretin receptors (kapp ≈ 0,1 min-1). In the Gαs-deficient mouse fibroblast cell line 2B2, the signal transduction cascade GPCR Gαs adenylyl cyclase was reconstituted by transiently expressing Gαs splice variants. Adenylyl cyclase activity was measured in the plasma membranes. Direct activation of Gαs splice variants showed them to be comparably effective and potent in activating adenylyl cyclase with half-maximal effective concentrations of 0.24-0.31 nM. Due to the similarity of these values, adenylyl cyclase activity could be taken as a measure of the interaction between GPCR and Gαs. The splice variants were comparably potent in receptor-mediated adenylyl cyclase activation by the β2-adrenergic, glucagon, histamine, secretin, vasopressin, and luteinising hormone receptors. However, the reason for the expression of four different splice variants remains to be elucidated; interactions with other signalling molecules such as tubulin and Src family tyrosine kinases are discussed.
