dc.contributor.author
Klippenstein, Viktoria
dc.date.accessioned
2018-06-07T20:44:43Z
dc.date.available
2015-05-13T07:55:18.127Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/7091
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-11290
dc.description.abstract
Ionotropic glutamate receptors (iGluRs) are ubiquitous in the mammalian brain
and the AMPA subtype is essential for fast, glutamate-activated postsynaptic
currents. In the framework of this study, photoactive unnatural amino acid
(UAA) crosslinkers as p-Benzoyl-L-phenylalanine (BzF, also known as Bpa) or
p-Azido-L-phenylalanine (AzF) were incorporated site-specifically into AMPA
receptors expressed in mammalian cells. Incorporation was performed via
genetically encoded UAA mutagenesis using specific orthogonal tRNA / tRNA-
synthetase pairs. This approach has been shown to be a powerful extension of
site-directed mutagenesis, which has allowed systematic structure-function
studies of a range of ion channels, however, its application to ligand-gated
ion channels as the glutamate receptors has been sparse. The aim of this study
was the extension of the use of UAAs in photoinactivation of AMPA receptors.
The establishment and thorough characterization of UAA photocrosslinking in
AMPA receptors has been a fundamental part of the study. Methodologically, UV-
driven photocrosslinking was detected by means of rapid perfusion outside-out
patch-clamp electrophysiology, and assessed by biochemical experiments.
Electrophysiological measurements revealed, that receptors rescued by
incorporation of AzF or BzF within the lower ligand-binding domain (LBD)
interface had nearly invariably similar properties to wild-type (WT) channels
and were expressed at similar levels. BzF incorporation at these subunit
interfaces within the LBD allowed photocrosslinking of subunits, which was
induced by UV irradiation at 365 nm from a mercury lamp. Photoinactivation was
characterized by peak current reduction of ~90% within ~10 seconds of
cumulative UV exposure. BzF incorporation led to selective and potent UV-
driven photoinactivation of both homomeric (GluA2) and heteromeric
(GluA2:GluA1) AMPA receptors. State dependence of trapping at two sites in the
lower lobe of the LBD is consistent with deformation of the LBDs as well as
intersubunit rearrangements during AMPA receptor desensitization. These
experiments demonstrate, that UAAs are a useful tool for exploring structural
rearrangements of the AMPA receptor and suggest relevant applications of
photoinactivation of glutamate receptor ion channels in native systems.
de
dc.description.abstract
Ionotrope Glutamatrezeptoren (iGluRs) gehören zu einer der häufigsten
Rezeptorfamilien in unserem Gehirn, wobei der AMPA-Subtyp mit seiner Erzeugung
von glutamat-aktivierten elektrischen Strömen in der Postsynapse eine zentrale
Rolle bei der Signalübertragung zwischen Nervenzellen spielt. Im Rahmen dieser
Arbeit wurden photoaktive unnatürliche Aminosäuren wie
p-Benzoyl-L-phenylalanin (BzF, auch bekannt als Bpa) oder
p-Azido-L-phenylalanin (AzF) positions-spezifisch innerhalb von AMPA-
Rezeptoren eingebaut, die in Säugetierzellen (HEK-293) exprimiert wurden. Der
Einbau erfolgte über die so genannte genetisch-kodierte unnatürliche
Aminosäure-Mutagenese, die auf die Verwendung spezifischer orthogonaler tRNA /
tRNA-Synthetase-Paare beruht. Die Nutzung unnatürlicher Aminosäuren hat sich
in früheren Studien als eine leistungsstarke Erweiterung der herkömmlichen
positions-spezifischen Mutagenese bewiesen und erlaubte systematische
Struktur-Funktions-Studien an einer Reihe von Ionenkanälen. Ihre Anwendung auf
Liganden-gesteuerte Ionenkanäle, wie etwa der Glutamatrezeptoren, war jedoch
bislang spärlich. Das Ziel dieser Studie bestand darin, die Nutzung von
unnatürlichen Aminosäuren auf AMPA-Rezeptoren zu übertragen und dadurch ihre
Photoinaktivierung auszulösen. Die Etablierung sowie gründliche
Charakterisierung der Photoinaktivierung von AMPA-Rezeptoren mittels
unnatürlicher Aminosäuren war ein grundlegender Bestandteil der Studie. Die
Rezeptorphotoinaktivierung wurde methodisch mittels elektrischer
Stromableitungen aus “outside-out patches” nach rascher Glutamatperfusion
untersucht und die Ergebnisse wurden durch biochemische Experimente bestätigt.
Die elektrophysiologischen Messungen haben ergeben, dass die unnatürlichen
Aminosäuren AzF und BzF erfolgreich in die untere Ligandenbindedomäne (LBD)
des Rezeptors eingebaut wurden, wobei die mutierten AMPA-Rezeptoren ähnliche
kinetische Eigenschaften wie die Wildtyp (WT)-Ionenkanäle zeigten. Der orts-
spezifische Einbau von BzF in die LBD erlaubte eine Vernetzung von
Rezeptoruntereinheiten, welche durch eine UV-Bestrahlung bei 365 nm aus einer
Quecksilberlampe induziert wurde. Die Photoinaktivierung zeichnete sich durch
eine 90%ige Reduzierung der Amplitude des abgeleiteten Stromes innerhalb von
~10 Sekunden kumulativer UV-Belichtung aus. Der Einbau von BzF führte zu einer
selektiven UV-ausgelösten Photoinaktivierung sowohl in homomeren (GluA2) als
auch in heteromeren (GluA2:GluA1) AMPA-Rezeptoren. Dadurch konnten
verschiedene funktionale Zustände des Rezeptors eingefangen werden, die der
vorausgesagten Verformung der LBDen, sowie der strukturellen Umlagerungen
während der AMPA-Rezeptor-Desensibilisierung, entsprachen. Die präsentierten
Ergebnisse zeigen, dass unnatürliche Aminosäuren hervorragend dazu geeignet
sind, strukturelle Änderungen von AMPA-Rezeptoren zu untersuchen und
dementsprechend die Anwendung der Photoinaktivierung auf native Systeme
übertragen werden könnte.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Light-sensitive glutamate receptor
dc.subject
unnatural amino acids
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Photoinactivation of glutamate receptors by genetically encoded unnatural
amino acids
dc.contributor.firstReferee
N.N.
dc.contributor.furtherReferee
N.N.
dc.date.accepted
2015-05-30
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000099210-7
dc.title.translated
Photoinaktivierung von Glutamatrezeptoren durch genetisch-kodierte
unnatürliche Aminosäuren
de
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000099210
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000017003
dcterms.accessRights.dnb
free
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open access