Glycan recognition by glycan-binding proteins is a fundamental process of life. Many members of the diverse family of the myeloid C-type lectin receptors serve as immune receptors recognizing complex glycan structures on pathogen surfaces and host cells and are involved in immune cell activation and regulation. Their restricted expression on defined subsets of antigen presenting cells as well as their exploitation for invasion by some adapted pathogens such as mycobacteria and HIV, and their function in immune cell activation render them attractive targets for novel therapies. A better insight into the underlying molecular processes that govern glycan binding and release as well as confer glycan specificity is a prerequisite to understand the onset of disease and subsequently develop new therapeutic approaches. The endocytic C-type lectin receptor Langerin, which is expressed on Langerhans cells and specific dendritic cell subsets, was chosen as a model to gain insight into the molecular mechanism of calcium-dependent glycan binding and release in the early endosome that is required for recycling receptors. To this end, biomolecular NMR provided the tools to investigate the structure and dynamics changes of the protein upon binding and release of the essential co- factor calcium and carbohydrate ligands. Whereas the apo form exists in two distinct conformational states and experiences motions on timescales from pico- to nanosecond bond vector fluctuations to very slow cis/trans prolyl bond isomerization on the second timescale, the holo form shows highly reduced mobility on the slower timescales. Moreover, calcium binding is controlled by an allosteric mechanism that involves a large network of interacting residues. This allosteric network was probed by single-residue mutations thereby discovering the function of the network to down-regulate calcium affinity in a partially pH-dependent manner. These findings suggest that the allosteric network promotes fast ligand release in the early endosome. In contrast, binding of simple and complex carbohydrate ligand did not activate the allosteric mechanism suggesting that glycan recognition is controlled on a higher level of organization. To assess whether the function of Langerin is conserved within the mammalian lineage, glycan binding propensities of human and murine Langerin were investigated side-by-side with respect to their capability to recognize simple carbohydrates and complex microbial polysaccharides. While recognition of simple mono- and disaccharides was almost identical in respect to affinity and binding mode, complex glycans were bound with both differential avidity and highly diverging specificities. In conclusion, the findings presented within this dissertation demonstrate how intra-domain allostery and protein dynamics regulate ligand binding and release in an endocytic C-type lectin receptor in a co-factor dependent manner. Moreover, this work shows how closely related glycan binding proteins of the immune system readily adopt to the host ecological niche by evolving differential binding specificities for complex microbial glycan ligands.
Erkennung von Glykanen durch ihre Rezeptoren ist ein fundamentaler Prozess des Lebens. Viele Mitglieder der vielfältigen Familie der myeloiden C-Typ- Lektinrezeptoren dienen als Immunrezeptoren, welche komplexe Glykanstrukturen auf Pathogenoberflächen und Wirtszellen erkennen, und damit häufig bei der Immunzellaktivierung und –regulierung beteiligt sind. Ihre eingeschränkte Expression auf definierten Untergruppen von Antigen-präsentierenden Zellen, die Nutzung dieser Rezeptoren zur Wirtszellinvasion durch angepasste Pathogen, wie Mykobakterien und HIV, und ihre Funktion in Immunzellaktivierung, ermöglichen vielfältige neue Therapieansätze. Für die Entwicklung neuartiger Ansätze ist es eine Voraussetzung, dass ein verbessertes Verständnis der grundlegenden molekularen Prozesse erlangt wird. Besonders in Hinblick auf die Glykanbindung und –freisetzung, sowie Glykanspezifität sind weitesgehend unverstanden. Das endozytische C-Typ-Lectin Langerin, welches auf Langerhanszellen und anderen Untergruppen dendritischer Zellen exprimiert wird, wurde als Modell ausgewählt, um vertiefte Erkenntnis über den molekularen Mechanismus der Calcium-abhängigen Glykanbindung und –freisetzung im frühen Endosom zu gewinnen. Biomolekulare Kernspinresonanzspektroskopie wurde erfolgreich zur Untersuchung der Struktur- und Dynamikveränderungen des Proteins durch Bindung und Freisetzung von Calcium und Kohlenhydratliganden eingesetzt. Während die Apoform des Rezeptors in zwei unterschiedlichen Konformationen existiert und molekulare Bewegungen von Bindungsvektorfluktuation im Pico- bis Nanosekundenbereich bis hin zu sehr langsamer cis/trans-Isomerisierung einer zentralen Prolinpeptidbindung im Sekundenbereich erfährt, ist die Holoform in einer Konformation gefangen und zeigt reduzierte Mobilität auf der Micro- bis Millisekundenzeitskala. Zudem wird Calciumbindung durch einen allosterischen Mechanismus kontrolliert, welcher ein großes Netzwerk interagierender Reste umfasst. Einzelpunktmutationen haben gezeigt, dass das allosterische Netzwerk die Calciumaffinität abhängig vom pH-Wert der Umgebung reduziert. Die Ergebnisse suggerieren, dass das allosterische Netzwerk die schnelle Freisetzung von Liganden im frühen Endosom begünstigt. Dagegen hat die Bindung von einfachen und komplexen Kohlenhydratliganden das allosterische Netzwerk nicht aktiviert, was darauf hindeutet, dass Glykanerkennung auf einer höheren Organisationsebene kontrolliert wird. Um zu ermitteln, ob die Funktion von Langerin in Säugetierspezies konserviert ist, wurden die Glykanbindungseigenschaften von humanen und murinen Langerin parallel untersucht. Dabei wurde insbesondere die Fähigkeit zur Erkennung von einfachen Kohlenhydraten und komplexen bakteriellen Polysacchariden untersucht. Während die Erkennung von einfachen Strukturen in Bezug auf Affinität und Bindungsmodus fast identisch war, wurden komplexe Glykane mit unterschiedlicher Avidität und Spezifität erkannt. Zusammenfassend zeigen die in dieser Dissertation präsentierten Erkenntnisse, wie Intradomänenallosterie und Proteindynamik Ligandenbindung und –freisetzung in einem endozytischen C -Typ-Lectin Kofaktor-abhängig steuern. Darüber hinaus zeigt diese Arbeit, wie im Immunsystem eng verwandte Glykan-bindende Proteine sich durch differenzierte Spezifität für mikrobielle Glykanliganden schnell an ihre ökologische Nische anpassen können.
