This thesis describes the synthesis of a series of precision glycomacromolecules and a study of their multivalent binding thermodynamics and kinetics in the interaction with model lectin Con A. Previous studies performed with glycopolymers, which present an important class of glycomimetics, have revealed that affinities and selectivities of glycopolymer-protein interactions depend on the arrangement of carbohydrate ligands presented on the polymer scaffold, as well as the scaffold’s composition and architecture. However, the thermodynamic and kinetic origin of such differences in protein binding in dependence of the polymer scaffold, have not been studied in much detail so far. One reason is the challenges associated with the synthesis of classical glycopolymers, which usually do not allow for a modular and straightforward exchange of certain structural motifs within the polymer scaffold. One approach to overcome this challenge – the one that is described in this thesis – is to design representative glycopolymer model systems, with exact control over their structural properties, as it has been shown with the recently introduced solid phase polymer synthesis (SPPoS) of so-called precision glycomacromolecules. Therefore, the here presented work was particularly interested in the structural features required for these model systems to lead to differences in the binding thermodynamics and kinetics in the association between the glycomacromolecules and the protein. The backbone of the glycomacromolecules was built up by different building blocks previously introduced for SPPoS. Their use allowed for the conjugation of different Man derivatives as well as the alternation of the spacing in terms of a varied ligand density along with the chemical composition of the scaffold. Specifically, different Man linkage on the oligomer backbone was ascertained, varying from a small ethyl triazole linker, over a longer thiol- ether triazole linker to a hydrophobic benzyl triazole linker. Additionally, a different backbone composition by the exchange of different spacer building blocks was achieved. Further, using SPPoS not only linear glycomacromolecules were synthesized but also cyclic glycomacromolecules were obtained. Evaluation of the different cyclization strategies on solid support revealed a two-step method to be best suited for the synthesis of cyclic precision glycomacromolecules, where first a protecting group is removed from the linear precursor before macrocyclization through the formation of an intramolecular amide bond. Further, a potential new tandem reaction to obtain cyclic oligo(amido amines) as scaffold for later glycoconjugation and synthesis of macrocyclic cationic oligo(amido amines) was evaluated, but showed unselective formation of N-substituted imides rather than the synthesis of monocyclic rings. The synthesis of the here reported linear and cyclic glycomacromolecules and the modular exchange of their structural features allowed a systematic elucidation of the influence of (i) the ligand density and the spacer length and its chemical composition, (ii) the chemical composition of the linker and its length, (iii) the number of carbohydrate ligands, (iv) the size of the backbone, (v) the change in the overall architecture from linear to cyclic and (vi) the valency of the multivalent glycomacromolecules, on their multivalent binding. Furthermore, the valency of the protein, either predominantly dimer or tetramer Con A, was varied by controlling the pH. The impact on the multivalent binding mechanism was evaluated by measuring their binding energetics and kinetics, such as the binding enthalpy ∆H, entropy -T∆S, binding free energy ∆G, heat capacity ∆C_p, the on- and off-rate constants (k_on and k_off values) and the transition state of the binding process using Isothermal Titration Calorimetry (ITC) and the recently introduced kinetic ITC (kinITC). Different correlations between changing the scaffold of the glycomacromolecules and the resulting thermodynamic and kinetic contributions were observed, that might also relate to similar findings for other glycopolymer systems and help to further improve the design of glycopolymers as glycomimetics. In short, values in ∆G were very similar for all glycomacromolecules with the same valency, suggesting ∆G to be insensitive to changes in ligand density and spacer composition. No clear trend regarding the enthalpic and entropic contributions was found for glycomacromolecules varying in their spacing. Further, an architectural change from linear to cyclic glycomacromolecules resulted in similar ∆G values. The enthalpic and entropic values of glycomacromolecules and their binding to dimer and tetramer Con A pinpoint to a sterical hinderance with tetramer Con A that is missing with dimer Con A. Another representative trend was found for glycomacromolecules with different Man linkers. Insertion of the different Man linkers has led to a steady increase in the binding affinity in the order short ethyl triazole linker < thiol-ether triazole linker < benzyl triazole linker with dimer Con A and tetramer Con A for mono- to trivalent compounds, and thiol-ether triazole linker < short ethyl triazole linker < benzyl triazole linker for penta- to decavalent compounds and tetramer Con A. The presented study suggests that this is not an effect of the additional ligand- receptor contacts, which have led to higher binding affinities, but is rather due to secondary effects from the linker’s chemical composition. From the kinetic studies, it was found that the binding of glycomacromolecules with dimer Con A seems to follow a rebinding mechanism, as it has been proposed by Hunter and Anderson and Weber et al.. Here fast k_on and k_off rates indicate the population of partially bound states as long as the glycomacromolecules and the protein associate. In contrast, the binding of glycomacromolecules to tetramer Con A is indicative of the binding and sliding mechanism, as proposed by Brewer et al.. Here, exponentially accelerated k_on values and k_off values, which stayed reduced or even further decreased, are representative for this binding mode. Regarding the Man density and the Man linkers, the same trend was found in the kinetic rate constants as has been found in their binding thermodynamics: While the on- and off-rate were rather insensitive to a changing Man density and oligomer architecture, the Man linkers showed a clear difference in the values of the association and dissociation rate constants. Analysis of the transition state revealed again a similar trend as observed for the previous values: An increasing valency has led to a lower activation free energy 〖∆G〗_on^‡, whereas molecules with the same valency but different ligand density or architecture essentially exhibit the same activation free energy 〖∆G〗_on^‡. Regarding the different linkers presented on the glycomacromolecules, evaluation of the transition state has shown that glycomacromolecules with a benzyl triazole linkage obtain the lowest activation energy barrier 〖∆G〗_on^‡, followed by the thiol-ether triazole and the ethyl triazole linked glycomacromolecules for the association process. The reverse is true for the dissociation transition state 〖∆G〗_off^‡. Overall, in this thesis a systematic study of the binding energetics and kinetics of multivalent precision glycomacromolecules binding to dimer and tetramer Con A has been reported by using thermodynamic and kinetic ITC. Changes in the binding energetics and kinetics have been related to their varying scaffold properties. Thus, this study further promotes a deeper insight into the multivalent binding of precision glycomacromolecules and thereby their role as model systems for fundamental studies on multivalency as well as their potential use in biotechnological and biomedical applications.
Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Synthese einer Serie von Präzisionsglykomakromolekülen und der Analyse der Thermodynamik and Kinetik der multivalenten Wechselwirkungen mit dem Modellektin Con A. Vorhergehende Studien mit Glykopolymeren als eine wichtige Klasse der Glykomimetika haben gezeigt, dass Bindungsaffinitäten und -selektivitäten der Glykopolymer-Protein Wechselwirkungen von der Anordnung der Kohlenhydrat-Liganden auf dem Polymer- Grundgerüst, sowie von der Grundgerüstzusammensetzung und -architektur abhängen. Allerdings wurde der thermodynamische und kinetische Ursprung solcher Unterschiede in der Bindung zum Protein in Abhängigkeit vom Polymer- Grundgerüst bislang nicht detailliert untersucht. Eine der Gründe dafür sind die Herausforderungen der Synthese klassischer Glykopolymere, die bislang noch keinen modularen und direkten Austausch bestimmter struktureller Motive im Polymergerüst ermöglichen. Ein Ansatz, um diese Herausforderung zu überwinden und der in dieser Arbeit beschrieben wird, ist die Verwendung repräsentativer Glykopolymer Modelsysteme mit exakter Kontrolle über die strukturellen Eigenschaften. Mit Hilfe der kürzlich eingeführten Festphasenpolymersynthese können solche sogenannten Präzisionsglykomakromoleküle erzeugt werden. Die vorliegende Arbeit interessierte sich daher insbesondere für die strukturellen Eigenschaften der Präzisionsglykomakromoleküle, die potenziell zu Unterschieden in der Bindungsthermodynamik und -kinetik bei der Assoziation zwischen den Glykomakromolekülen und dem Modellektin Con A führen. Das Gerüst der Glykomakromoleküle wurde hierzu aus verschiedenen Bausteinen zusammengesetzt, die zuvor für die Festphasenpolymersynthese etabliert wurden. Ihre Verwendung erlaubte die Konjugation unterschiedlicher Man Derivate, sowie die gezielte Variation der Ligandendichte und der chemischen Zusammensetzung des Gerüsts. Auf diese Weise wurden zum einen unterschiedliche Man Linker zum Rückgrat eingeführt – von einem kurzen Ethyl Triazol Linker, über einen längeren Thiol-Ether Triazol Linker zu einem hydrophoben Benzol Triazol Linker. Zum anderen wurden unterschiedliche Rückgrat Zusammensetzung durch den Austausch verschiedener Spacer Bausteine realisiert. Durch die Nutzung der Festphasenpolymersynthese war es weiterhin möglich nicht nur lineare Glykomakromoleküle zu synthetisieren, sondern auch zyklische Glykomakromoleküle zu erhalten. Eine Evaluierung unterschiedlicher Zyklisierungsstrategien auf der Festphase haben ergeben, dass eine Zwei- Schritt-Methode für die Synthese zyklischer Präzisionsglykomakromoleküle am besten geeignet ist. Zunächst wird hierzu die Schutzgruppe am linearen Precursor entfernt und darauf folgend die Makrozyklisierung unter Bildung einer intramolekularen Amid Bindung durchgeführt. In diesem Zusammenhang wurde auch eine potentiell neue Tandem Reaktion für die Synthese zyklischer Oligo(amido amine) als Rückgrat für eine spätere Glyko-Konjugation beziehungsweise (bzw.) die Synthese von zyklischen kationischen Oligo(amido aminen) untersucht. Diese zeigte jedoch eine unselektive N-substituierte Imid- Bildung anstatt der Synthese von monozyklischen Ringen. Die erfolgreiche Synthese der in dieser Arbeit gezeigten linearen und zyklischen Glykomakromoleküle, sowie der modulare Austausch ihrer strukturellen Merkmale erlaubten dann die systematische Untersuchung des Einflusses folgender struktureller Eigenschaften auf die multivalente Bindung zum Protein: (i) Die Ligandendichte and Spacer-Länge, sowie ihre chemische Zusammensetzung, (ii) die chemische Zusammensetzung der Linker und ihrer Länge, (iii) die Anzahl der Kohlenhydrat-Liganden, (iv) die Größe des Grundgerüsts, (v) die Veränderung der gesamten Polymer-Architektur von linear zu zyklisch und (vi) die Valenz der Glykomakromoleküle. Weiterhin wurde die Valenz des Proteins durch die Kontrolle des pH Wertes variiert, wobei entweder überwiegend das Con A Dimer oder Tetramer vorhanden sind. Die Auswirkung der oben genannten Strukturvariationen der Glykomimetika, sowie die Valenz des Proteins auf deren multivalenten Bindung, wurden durch Messung der Bindungsenergien und -kinetik, wie zum Beispiel der Bindungsenthalpie ∆H, -entropie -T∆S, der Freien Bindungsenergie ∆G, der Wärmekapazität ∆C_p, der Assoziations- und Dissoziations-Geschwindigkeitskonstanten (k_on und k_off) und dem Übergangszustand der Bindungsprozesse untersucht. Diese thermodynamischen und kinetischen Größen wurden mit Hilfe der Isothermalen Titrationskalorimetrie (ITC) und der erst kürzlich eingeführten kinetischen ITC (kinITC) ermittelt. Unterschiedliche Korrelationen zwischen den Strukturvariationen der Glykomakromoleküle und den resultierenden thermodynamischen und kinetischen Beiträgen wurden gefunden. Diese Beiträge können potenziell auch auf andere Glykopolymere übertragen werden und dabei helfen, neue und verbesserte Glykopolymere als Glykomimetika zu entwickeln. Zusammenfassend konnte die vorliegende Studie zeigen, dass die Werte in ∆G sehr ähnlich sind für alle Glykomakromoleküle mit derselben Valenz, während ∆G unempfindlich gegenüber den Veränderungen in der Ligandendichte und Spacer-Zusammensetzung ist. Kein klarer Trend wurde in Bezug auf die enthalpischen und entropischen Beiträge gefunden für Glykomakromoleküle, die sich in ihrer Ligandendichte unterscheiden. Weiterhin führte die Architekturveränderung von linearen zu zyklischen Glykomakromolekülen zu keiner Änderung der Werte für ∆G. Die enthalpischen und entropischen Beiträge der Bindung von Glykomakromolekülen am Con A Dimer und Tetramer deuten auf eine sterische Hinderung bei Bindung an das Con A Tetramer hin, die bei dem Con A Dimer nicht gefunden wurde. Ein anderer repräsentativer Trend wurde für Glykomakromoleküle gefunden, die sich in ihren Man Linkern unterscheiden. Die Einführung unterschiedlicher Man Linker hat zu einer stetig steigenden Bindungsaffinität geführt, in der Reihenfolge Ethyl Triazol Linker < Thiol-Ether Triazol Linker < Benzol Triazol Linker bei Bindung an das Con A Dimer, sowie dem Con A Tetramer für mono- bis trivalente Verbindungen, und Thiol-Ether Triazol Linker < Ethyl Triazol Linker < Benzyl Triazole Linker für penta- bis decavalente Verbindungen und ihrer Bindung an das Con A Tetramer. Die hier präsentierte Studie deutet an, dass dieser Effekt nicht das Ergebnis zusätzlicher Liganden-Rezeptor-Kontakte ist, die zu einer höheren Bindungsaffinität geführt haben, sondern eher das Resultat sekundärer Effekte ist, die durch die Variation in der chemischen Zusammensetzung der Linker zustande gekommen sind. Die kinetischen Studien haben gezeigt, dass die Bindung von Glykomakromolekülen an das Con A Dimer dem rebinding Mechanismus zu folgen scheint, so wie dieser von Hunter und Anderson, sowie Weber et al. vorgeschlagen wurde. In einem solchen Mechanismus deuten die k_on and k_off Geschwindigkeitskonstanten auf die Population von partiell gebundenen Bindungszuständen hin, solange die Glykomakromoleküle und das Protein sich in der Assoziationsphase befinden. Im Gegensatz dazu deuten die kinetischen Daten für die Glykomakromoleküle, die an das Con A Tetramer binden, eher auf den binding and sliding Mechanismus hin, so wie er von Brewer et al. vorgeschlagen wurde. Für diesen Bindungsmodus sind exponentiell beschleunigte k_on Werte, sowie reduzierte oder sogar weiter verringte k_off Werte repräsentativ. Bezüglich der Man Linkern wurde derselbe Trend in den Geschwindigkeitskonstanten gefunden, der bereits in den thermodynamischen Daten beobachtet wurde: Während die k_on and k_off Werte eher unempfindlich gegenüber einer sich veränderten Man Dichte sind, wurden klare Unterschiede für die unterschiedlichen Man Linker in den Assoziations- und Dissoziations- Geschwindigkeitskonstanten gefunden. Die Analyse der Übergangszustände zeigte erneut einen ähnlichen Trend wie bei den vorangegangenen Messreihen: Eine steigende Valenz der Glykomakromoleküle führt zu einer stetigen Verminderung der Freien Aktivierungsenregie 〖∆G〗_on^‡, wohingegen Moleküle derselben Valenz aber einer unterschiedlichen Ligandendichte oder Architektur im Wesentlichen die gleiche Freie Aktivierungsenergie 〖∆G〗_on^‡ aufweisen. Für die unterschiedlichen Linker Typen wurde die niedrigste Freie Aktivierungsenergie für die Benzol Triazol Linker gefunden, gefolgt vom Thiol-Ether Triazol Linker und dem Ethyl Triazol Linker mit der höchsten freien Aktivierungsenergie. Dies bezieht sich auf den gesamten Assoziationsprozess, wobei die umgekehrte Reihung für den Dissoziations-Übergangszustand 〖∆G〗_(off )^‡ gilt. Insgesamt präsentiert diese Arbeit somit eine systematische Studie der Bingungsenergien und -kinetik multivalenter Präzisionsglykomakromoleküle und ihrer Bindung an das Con A Dimer und Tetramer, die mit Hilfe der thermodynamischen und kinetischen ITC ermittelt wurden. Veränderungen der Bindungsenergien und -kinetik wurden direkt in Bezug zu den kontrolliert variierten Strukturen der Glykomakromoleküle gesetzt. Diese Studie trägt somit zu einem vertieften Verständnis multivalenter Bindungsprozesse von Präzisionsglykomakromolekülen bei und zeigt ihr Potenzial als Modelsysteme für Grundlagenstudien der Multivalenz, sowie ihre mögliche Anwendung in der Biotechnologie und Biomedizin.
