Funktion von Isoformen der Phospholipase C im Laubmoos Physcomitrella patens bei der Wahrnehmung abiotischer Umwelteinflüsse

Abstract

Umweltfaktoren wie Temperatur, Licht, Photoperiode und Wasserbedarf prägen das Leben der sessilen Pflanzen in ganz besonderer Weise. Die Signale müssen perzipiert und transduziert werden, um die Systeme auf die entsprechende Antwort zu programmieren, damit sich die Pflanze an die Bedingungen adaptieren kann. Oft verläuft die Signalweiterleitung von Umweltreizen in Pflanzen über eine phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C (PI-PLC). PLCs katalysieren die Hydrolyse von PIP2 (Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat) zu den Second Messengern IP3 (Inositol-1,4,5,- triphosphat) und DAG (Diacylglycerin). Ein zweiter Typ PI-PLC zeigt keine Spezifität gegenüber PIP2 als Substrat. Bei Erhöhung der Calciumkozentration erhöht sich die Präferenz gegenüber PI (Phosphatidylinositol) als Substrat. Im Laubmoos Physcomitrella patens sind vier verschiedene PLC-kodierende Gene bekannt. Zwei Isoformen (PpPLC1 und PpPLC2) gehören jeweils zu unterschiedlichen biochemischen Phospholipasen C. PpPLC1 hydrolisiert bevorzugt PIP2 (Repp et al., 2004), während PpPLC2 erst bei milimolaren Calciumkonzentrationen eine Präferenz gegenüber PI zeigt (Mikami et al., 2004). Die physiologische Bedeutung dieser Isoform wurde in vorliegender Arbeit durch zielgerichteten knockout des Gens geklärt. Weiterhin wurde die Expression des Gens bei verschiedenen Umweltbedingungen analysiert. Biochemisch wurde die Substratbindung des Enzyms überprüft und die Lokalisation in der Zelle untersucht. Zwei weitere plc-Gene (plc3 und plc4) aus Physcomitrella patens wurden isoliert und sequenziert. Ein Vergleich der vier Sequenzen macht eine Unterteilung in zwei strukturell unterschiedliche Gruppen deutlich bei denen sich die plc2- und plc3-Sequenzen in wichtigen Aspekten von den anderen bekannten pflanzlichen plc-Sequenzen unterscheiden.

In eukaryotes phosphoinositide-specific phospholipase C (PI-PLC) plays an important role in various signal transduction pathways. Plant PI-PLCs are part of signalling osmotic stress, gravity- and lightperception. The moss Physcomitrella patens contains at least four genes encoding PI-PLCs. Analysis of the amino acid sequences revealed two separate groups (PpPLC1 and 4, PpPLC2 and 3). One member of each group was characterised enzymatically (PpPLC1 and PpPLC2), showing that they belong to biochemically different PLCs (Mikami et al. 2004). We generated plc1 and plc2 gene-targeted knockouts via homologous recombination in Physcomitrella. The role of PpPLC1 was described elsewhere (Repp et al., 2004). The knockout of PpPLC2 has no obvious phenotype under standard growth conditions. However, the treatment with stress mediating substances like abscisic acid or mannitol, indicated that PpPLC2 is involved in ABA-dependent stress signalling. We also characterized the expression of the enzyme under this condition. The binding of recombinant PLC-Isoformes to several substrates as well as the localization of the protein were investigated. Plc2- and plc3-sequences show different structural characteristics compared to several known plant plc-sequences.