Photoreceptors are important model systems for the investigation of protein signal transduction and protein kinetics in general. Because they are activated by light it is possible to resolve their activation kinetics with high time resolution by optical methods. In this thesis I methodically focus on time resolved fluorescence spectroscopy as a tool to characterize the light-induced conformational changes associated with the activation of several photoreceptors. Furthermore I introduce the method of transient fluorescence spectroscopy as a valuable tool to study the kinetics of the activation processes. Transient absorption spectroscopy is used as a complementary technique. This study´s emphasis is on measurements on Photoactive Yellow Protein (PYP) which is the structural prototype of the ubiquitous PAS domain family. Additionally the photoreceptors rhodopsin and the LOV2 domain from phototropin 1 are investigated to show the general applicability of the introduced methods. Chapter 1 provides a general introduction to the investigated biological systems Photoactive Yellow Protein, rhodopsin and LOV2. Moreover the applied methods are explained. Chapter 2 (Otto et al. (2005) Biochemistry 44, 16804-16816) is about time resolved fluorescence intensity and depolarization experiments on the unique tryptophan W119 of PYP from Halorhodospira halophila whose fluorescence is quenched by energy transfer to the 4-hydroxycinnamoyl chromophore of the protein. The different fluorescence lifetimes of several photointermediates could be explained by dramatic changes of the k2 factor due to changes in the orientation of the chromophore transition dipole moment. The k2 factors were calculated from high resolution X-ray structures. The results of this chapter were already part of my diploma thesis and are shown here because they provide the background of some of the work described in the following chapters. Chapter 3 (Hoersch et al. (2008) J. Phys. Chem. B 112, 9118-9125) introduces the technique of transient fluorescence spectroscopy to study the photocycle kinetics of PYP at alkaline pH. In this way the tryptophan fluorescence lifetime of the short living intermediate I1 could be determined. In a next step it was compared with calculated lifetimes, based on two different I1 high resolution X-ray structures. As only one of the calculated lifetimes was in agreement with the experiment, we could exclude one of the structures, which is presumably not present in solution at alkaline pH. Additionally we determined the tryptophan fluorescence lifetime of the alkaline intermediate I1´ from measurements of the tryptophan fluorescence decay in a photostationary equilibrium under background illumination. We predicted the chromophore conformation of this intermediate for which the crystal structure is not yet known to be similar to that of the I2 intermediate. Chapter 4 (Hoersch et al. (2007) Biophysical Journal 93, 1687-1699) is about the role of a conserved salt bridge between the PAS core and the N-terminal domain in the activation of PYP. Therefore the effect of ionic strength on the conformational equilibrium between the I2 intermediate and the signaling state I2´ and on the recovery rate was investigated by time resolved absorption and fluorescence spectroscopy. The salt dependency of the equilibrium constant and the recovery rate could be explained quantitatively by the screening of a monovalent ion pair. Furthermore the salt effect was eliminated in the mutant K110A below 600 mM KCl. Thus we concluded that the salt linkage K110/E12 between the b-sheet of the PAS core and the N-terminal domain stabilizes the photoreceptor in the inactive state in the dark and is broken in the light-induced formation of the signaling state. In Chapter 5 (Hoersch et al. (2009) Physical Chemistry Chemical Physics, DOI: 10.1039/b821345c) the kinetics of the structural change in the N-terminal domain of PYP is investigated by transient absorption spectroscopy of the dye labeled mutants A5C and N13C. The transient red-shift of the absorption band of the attached dye iodoacetamidofluorescein (IAF) suggested conformational changes near the labeling sites. As the transient dye signal is correlated with the intermediate I2 in A5C-AF and with I2´ in N13C- AF we concluded that the light-induced structural signal propagates from the chromophore binding pocket via A5 to N13 where it causes major changes in the protein conformation. Chapter 6 (Hoersch et al. (2008) Biochemistry 47, 11518-11527) applies the technique of transient fluorescence spectroscopy to bovine rhodopsin. The transient tryptophan fluorescence of this photoreceptor decreases with the same kinetics as the rise of the MII state as measured by the transient absorption increase at 360 nm. This could be explained by an increase in energy transfer to the retinylidene chromophore caused by the increased spectral overlap in the signaling state MII. Furthermore the kinetics of the Alexa594 fluorescence increase in ROS membranes selectively labeled at cysteine 316 was measured and compared with the kinetics of the MII formation and the kinetics of the proton uptake from the solvent. As the fluorescence change lags behind the Schiff base deprotonation but precedes the proton uptake the sequence Schiff base deprotonation, structural change, proton uptake seems to be a good model for the molecular events of rhodopsin activation. So far this sequence of events has only been established with the less relevant rhodopsin/micelle systems and with different results. Chapter 7 deals with the transient tryptophan fluorescence of the light sensing LOV2-Ja domain of the photoreceptor phototropin1 from Avena sativa. The transient fluorescence signal of this domain increases biexponentially with time constants of 450 µs and 3.8 ms at 20 °C. As these transitions are invisible in the transient absorption data in the UV-VIS range we expanded the LOV2-Ja photocycle scheme by two more intermediates. These have the same absorption spectra but different tryptophan fluorescence quantum yields and are associated with previously undetected conformational changes of the protein. Furthermore we determined the activation energy of the mean transient fluorescence kinetics to be 18.2 kcal/mol. We compared this value with the activation energy of 18.5 kcal/mol for the I2/I2´ transition in the photoreceptor PYP which we measured also by transient tryptophan fluorescence spectroscopy. The similar kinetics of the conformational change in both photoreceptor systems may be related to their shared PAS domain fold. In Chapter 8 the results and conclusions of the experiments described in this thesis are summarized and future experiments are proposed.
Photorezeptoren sind wichtige Modellsysteme für die Untersuchung von Protein- Signaltransduktion und Protein-Kinetik im Allgemeinen. Da sie durch Licht aktiviert werden, ist es möglich die Kinetik des Aktivierungsprozesses mittels optischer Methoden mit hoher Zeitauflösung zu untersuchen. Der methodische Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der zeitaufgelösten Fluoreszenzspektroskopie als Mittel zur Untersuchung von lichtinduzierten, mit der Aktivierung unterschiedlicher Photorezeptoren assoziierten Konformationsänderungen. Darüber hinaus wird die Methode der transienten Fluoreszenzspektroskopie als wertvolles Mittel zur Untersuchung der Kinetik des Aktivierungsprozesses eingeführt. Transiente Absorptionsspektroskopie wird als komplementäre Methode verwendet. Die vorliegende Arbeit hat ihren Schwerpunkt in Messungen an Photoactive Yellow Protein (PYP), dem Struktur- Prototyp der weitverbeiteten Familie der PAS-Domänen. Außerdem wurden die Photorezeptoren Rhodopsin und die LOV2-Domäne des Phototropin1 untersucht, um die allgemeine Anwendbarkeit der eingeführten Methoden zu demonstrieren. In Kapitel 1 wird eine allgemeine Einführung in die untersuchten biologischen Systeme Photoactive Yellow Protein, Rhodopsin und LOV2 gegeben. Zusätzlich werden die angewendeten Methoden vorgestellt. Kapitel 2 (Otto et al. (2005) Biochemistry 44, 16804-16816) handelt von zeitaufgelösten Fluoreszenz- Intensitäts und -Depolarisationsmessungen am einzigen Tryptophan W119 des PYP aus dem Organismus Halorhodospira halophila, dessen Fluoreszenz durch Energietransfer zum 4-hydroxycinnamoyl Chromophor des Proteins gequenched wird. Die unterschiedlichen Fluoreszenzlebensdauern der einzelnen Photointermediate konnten durch dramatische Änderungen des k2-Faktors, verursacht durch Änderungen der Orientierung des Übergangdipolmoments des Chromophors, erklärt werden. Die k2-Faktoren wurden aus hochauflösenden Kristallstrukturen berechnet. Die Ergebnisse dieses Kapitels waren Teil meiner Diplomarbeit und werden hier nochmals aufgeführt, da sie für das Verständnis eines großen Teils der in den nachfolgenden Kapitel beschriebenen Arbeiten notwendig sind. Kapitel 3 (Hoersch et al. (2008) J. Phys. Chem. B 112, 9118-9125) führt die Methode der transienten Fluoreszenzspektroskopie als Mittel zur Untersuchung des Photozyklus des PYP im alkalischen pH-Bereich ein. Dadurch konnte die Fluoreszenzlebensdauer des kurzlebigen Intermediats I1 bestimmt werden. In nächsten Schritt wurde diese mit theoretischen Lebensdauern verglichen, die unter Zuhilfenahme zweier unterschiedlicher I1-Kristallstrukturen berechnet wurden. Da nur eine der berechneten Lebensdauern im Einklang mit den experimentell bestimmten Wert ist, konnte eine der Kristallstrukturen als nicht in Lösung bei alkalischem pH vorkommend ausgeschlossen werden. Außerdem wurde die Tryptophan-Fluoreszenzlebensdauer des alkalischen Intermediats I1´ aus Messungen des Tryptophan- Fluoreszenzzerfalls in einem photostationären Gleichgewicht unter Hintergrundbeleuchtung bestimmt. Die Chromophorkonformation dieses Intermediats, dessen Kristallstruktur noch nicht bekannt ist, wurde als I2 ähnlich vorausgesagt. Kapitel 4 (Hoersch et al. (2007) Biophysical Journal 93, 1687-1699) beschäftigt sich mit der Rolle einer konservierten Salzbrücke zwischen dem PAS-core und dem N-terminal cap in der Aktivierung von PYP. Dazu wurde der Effekt der Ionenstärke auf das Gleichgewicht zwischen den Intermediat I2 und dem Signalzustand I2´ und auf die Rückkehrrate untersucht. Die Salzabhängigkeit der Gleichgewichtskonstante und der Rückkehrrate konnte mit der Abschirmung eines monovalenten Ionenpaars erklärt werden. Außerdem verschwindet der Salzeffekt in der Mutante K110A unterhalb von 600 mM KCl. Daraus wurde geschlossen, dass die Salzbrücke K110/E12 zwischen dem b-Faltblatt des PAS-core und dem N-terminal cap den Photorezeptor in seinem inaktiven Zustand stabilisiert und in Folge der lichtinduzierten Bildung des Signalzustands aufbricht. In Kapitel 5 (Hoersch et al. (2009) Physical Chemistry Chemical Physics, DOI: 10.1039/b821345c) wird die Kinetik der Stukturänderung in der N-terminalen Domäne von PYP durch transiente Absorptionsspektroskopie an den farbstoffgelabelten Mutanten A5C und N13C untersucht. Die transiente Rotverschiebung der Absorptionsbande des gebundenen Farbstoffs Iodoacetamidofluorescein (IAF) legt Konformationsänderungen in der Umgebung der Labelstellen nahe. Da das transiente Farbstoffsignal in A5C-AF mit dem Intermediat I2 und in N13C-AF mit I2´ korreliert, wurde gefolgert, dass sich das lichtinduzierte Struktursignal von der Chromophorbindungstasche über A5 nach N13 hin ausbreitet, wo es größere Änderungen in der Proteinkonformation hervorruft. In Kapitel 6 (Hoersch et al. (2008) Biochemistry 47, 11518-11527) wird die Methode der transienten Fluoreszenzspektroskopie auf Rhodopsin angewendet. Die transiente Tryptophan- Fluoreszenz dieses Photorezeptors nimmt mit der gleichen Kinetik ab wie der transiente Anstieg der Absorption bei 360 nm. Dies konnte durch einen Steigerung des Energietransfers zum Retinal-Chromophor, verursacht durch eine Vergrößerung des spektralen Überlapps im Signalzustand MII, erklärt werden. Außerdem wurde die Kinetik des Anstiegs der Alexa594-Fluoreszenz in selektiv an Cystein 316 gelabelten ROS-Membranen gemessen. Diese wurde mit den Kinetiken der MII-Bildung und der Protonenaufnahme aus dem Lösungsmittel verglichen. Da die Fluoreszenz-Kinetik hinter der Kinetik der Schiff-Base Deprotonierung zurückbleibt aber der der Protonenaufnahme vorangeht, scheint die Reihenfolge Schiff-Base Deprotonierung, Strukturänderung, Protonenaufnahme die richtige Beschreibung der molekularen Ereignisse der Rhodopsin-Aktivierung zu sein. Bislang wurde diese Reihenfolge nur im weniger relevanten Rhodopsin/Mizellen System mit anderen Ergebnissen festgestellt. Kapitel 7 handelt von der transienten Tryptophan-Fluoreszenz der LOV2-Ja Domäne des Phototropin1 des Hafers. Das transiente Tryptophan-Fluoreszenzsignal steigt bei 20 °C biexponentiell mit den Zeitkonstanten von 450 µs und 3,8 ms an. Da diese Übergänge in den transienten Absorptionsdaten in UV-VIS Wellenlängenbereich nicht sichtbar sind muss das ursprüngliche LOV2-Photozyklusmodell um 2 zusätzliche Intermediate erweitert werden. Diese haben das gleiche Absorptionsspektrum aber unterschiedliche Tryptophan Fluoreszenzquantenausbeuten und sind mit Konformationsänderungen des Proteins assoziiert. Außerdem wurde die Aktivierungsenergie der mittleren Kinetik des transienten Fluoreszenzsignals von 18,2 kcal/mol gemessen. Der Wert wurde mit der Aktivierungsenergie von 18,5 kcal/mol für den I2/I2´-Übergang im Photorezeptor PYP verglichen, der ebenfalls mittels transienter Tryptophanfluoreszenz gemessen wurde. Die ähnliche Kinetik der Konformationsänderungen in beiden Photorezeptorsystemen könnte mit ihrer gemeinsamen PAS-Domänenstruktur in Zusammenhang stehen. In Kapitel 8 werden die Ergebnisse und Schlussfolgerungen der in dieser Arbeit dargestellten Experimente zusammengefasst und zukünftige Experimente vorgeschlagen.
