The tissue specific expression of developmental genes is encoded in enhancer elements often located hundreds of kb away from their cognate promoters. Physical chromatin interactions between these enhancers and target promoters are associated with active transcription and conventionally thought to be confined to topologically associating domains (TADs). However, little is known about the underlying nature and dynamics of this 3D-architecture during development and its perturbation in disease. In this work, the mouse embryonic limb bud was used as a paradigm to investigate the dynamics of gene regulation underlying the development of either arms or legs. Pitx1 is the one of few transcription factors shown to be expressed exclusively in hindlimbs and not in forelimbs. Yet, its regulation in mammals continues to be largely unknown. Here, we identified an unexpectedly complex regulatory basis of hindlimb- specific Pitx1 expression that expands the current model of enhancer sequences as the sole determinants of tissue specificity. We demonstrate that Pitx1 is regulated by the active fore- and hindlimb enhancer, Pen, that is required for normal expression of Pitx1 in hindlimbs, but does not activate Pitx1 expression in forelimbs. Investigation of the chromatin architecture of the Pitx1 locus in both fore-and hindlimb buds using cHi-C and derived 3D-models, revealed a modular regulatory landscape that is not confined to a TAD structure. Instead, Pitx1 is controlled by a Multi-Anchor Domain (MAD), which can assume distinct tissue-specific conformations. In the hindlimb, the locus forms an active MAD that enable Pen and Pitx1 interactions, producing a transcriptionally active pocket. Intriguingly, an alternate forelimb-specific MAD conformation prevents the promiscuous activity of Pen by physically separating it from Pitx1. Disruption of this segregated forelimb chromatin conformation in engineered mice, as well as in human Liebenberg syndrome patients, results in forelimb Pitx1 misexpression, and a partial transformation of forelimb morphology into a hindlimb-like. This work provides further understanding of gene regulation whereby unspecific enhancer activity is actively regulated by the dynamics in 3D-chromatin architecture, independent of TADs, to confer a tissue specific transcriptional output. Together our findings help build the groundwork for the interpretation of structural variants disrupting genome organisation, not only resulting in human disease, but also in the evolution of phenotypes in natural populations.
Die gewebespezifische Expression von Entwicklungsgenen wird durch Enhancerelemente gesteuerte, welche häufig hunderte Kilobasen von ihren Zielpromotoren entfernt liegen können. Physische Chromatininteraktionen zwischen diesen Enhancern und ihren Zielpromotoren werden mit aktiver Transkription in Zusammenhang gebracht und ist in der Regel auf „topologically associating domains“ (TADs) begrenzt. Allerdings ist noch wenig über die dieser 3D-Architektur in der Entwicklung zugrunde liegenden Natur und Dynamik bekannt und wie diese in Krankheiten gestört wird. In dieser Arbeit wurde die embryonale Extremitätenentwicklung der Maus als Paradigma genutzt, um die komplexe Genregulation während der spezifischen Arm- und Beinentwicklung zu untersuchen. Pitx1 ist einer der wenigen Transkriptionsfaktoren, die ausschließlich in den hinteren Extremitäten, und nicht in den vorderen Extremitäten, exprimiert werden. Dessen Regulation in Säugetieren ist jedoch bislang noch größtenteils unbekannt. Hier, wurde eine unerwartet komplexe regulatorische Grundlage für die Beinentwicklung spezifische Pitx1 Expression identifiziert. Diese erweitert das aktuelle Modell, welches Enhancersequenzen noch als alleinige Determinanten der Gewebespezifität benennt. Wir zeigen, dass Pitx1 von einem in Vorder-und Hintergliedmaßen aktiven Enhancer, genannt Pen, reguliert wird. Dieser wird in den hinteren Extremitäten für die Pitx1 Expression benötigt, führt aber in der regulären Entwicklung der Vordergliedmaßen zu keiner Pitx1 Aktivierung. Untersuchungen der Chromatinarchitektur, des Pitx1 Lokus in Extremitätenknospen von sowohl Vorder-, als auch Hintergliedmaßen, mittels „capture Hi-C“ und abgeleiteten 3D-Modellen, ergaben eine modulare regulatorische Landschaft, welche nicht auf eine TAD Struktur begrenzt ist. Stattdessen, konnte nachgewiesen werden, dass Pitx1 von einer „Multi-Anchor Domain“ (MAD), die Gewebespezifische Konformationen annehmen kann, gelenkt wird. In den Hintergliedmaßen formt der Lokus eine aktive MAD, die eine Interaktion zwischen Pen und Pitx1 ermöglicht, wobei eine transkriptionell aktive Tasche erzeugt wird. Interessanterweise verhindert eine alternative Vordergliedmaßen-spezifische MAD Konformation unspezifische Pen Aktivitäten, indem Pen physisch von Pitx1 getrennt wird. Störungen dieser segregierten Chromatinkonformation, sowohl in genetisch manipulierten Mäusen, als auch in menschlichen Patienten mit Liebenberg Syndrom, führen zu einer Misexpression von Pitx1 in den vorderen Extremitäten, wobei eine partielle Transformation der Vordergliedmaßenmorpholgie in eine den Hintergliedmaßen ähnlichen Struktur entsteht. Diese Arbeit schafft neue Erkenntnisse über Genregulation, da nachgewiesen wurde, dass, unabhängig von TADs unspezifische Enhancer in einer aktiven Weise von den Dynamiken der 3D- Architektur des Chromatins reguliert werden können, um gewebespezifische transkriptionelle Aktivität zu ermöglichen. Gemeinsam helfen unsere Erkenntnisse Grundlagen für die Interpretation von Strukturvariationen, welche die 3D-Organisation des Genoms stören, und dadurch nicht nur menschliche Erkrankungen, sondern auch die Beeinflussung der Evolution von Phänotypen in natürlichen Populationen zur Folge haben können, zu bilden.
