Ascorbinsäure und Ascorbinsäuresynthese bei Invertebraten: eine vergleichende Analyse

Abstract

Vergleichende Darstellungen der Ascorbinsäuresynthese bei Tieren kamen in der Vergangenheit zu der Annahme, dass sich diese Eigenschaft mehrfach entwickelt hat. Da die Ascorbinsäure essentiell für die Kollagensynthese und Kollagen als verbindendes Element der Zellen die Voraussetzung für alle vielzelligen Tiere ist, wird in der vorliegenden Arbeit die Idee verfolgt, dass die Ascorbinsäuresynthese ein altes Merkmal der Metazoa darstellt. Um diese These zu überprüfen, wurden zum Einen ursprüngliche Gruppen der mehrzelligen Tiere und zum Anderen den Wirbeltieren nahe stehende Gruppen untersucht. Für die experimentellen Bearbeitung wurden ein in vitro Enzymtest und eine HPLC- Methode für die Messung der Ascorbinsäurekonzentration etabliert. Zur Validisierung des in vitro Tests wurde mit einem histochemischen Verfahren die Aktivität eines in der Synthese entscheidenden Enzyms überprüft und mit molekularen Methoden nach der genetischen Grundlage dieses Enzyms gefahndet. Die vorliegende Arbeit zeigt die Ascorbinsäuresynthese bei dem Acrania Branchiostoma lanceolatum. Dies ist der erste Nachweis der Synthese für die Schwestergruppe der Wirbeltiere. Damit ist diese Eigenschaft nicht, wie derzeit angenommen, erst bei den Craniota vorhanden, sondern hat sich schon früher entwickelt. Mit dieser Arbeit wurde zusätzlich die Ascorbinsäuresynthese bei Schwämmen und Nesseltieren als ursprünglichen Vertretern der mehrzelligen Tiere nachgewiesen. Die Cnidaria Alcyonium digitatum, Aiptasia sp., Metridium senile, Sargatiogeton undata, Thuiaria thuja und der Vertreter der Porifera Chondrosia reniformis zeigten in vitro eine Synthese der Ascorbinsäure. Dir Nachweis der Synthese bei diesen Gruppen zeigt, dass es sich um eine ursprüngliche Eigenschaft aller Metazoa handelt. Die Ergebnisse bei A. digitatum und M. senile konnten mit einer histochemischen Methode abgesichert werden. Dabei stellte sich das Gastroderm als Ort der Synthese heraus. Bei der Untersuchung der Tunicate Ciona intestinalis konnte keine Produktion der Ascorbinsäure gefunden werden. Nur die Untersuchung weiterer Tunicata kann klären, ob keine Synthesefähigkeit in dieser Gruppe existiert oder ob C. intestinalis eine Ausnahme ist. Der Nierenschwamm C. reniformis war in der Lage sowohl aus der Vorstufe l-Gulonolacton, als auch l-Galactonolacton Ascorbinsäure zu synthetisieren. Dagegen konnte für A. digitatum und M. senile gezeigt werden, dass sie spezifisch das Substrat l-Gulonolacton zur Ascorbinsäure umsetzen und l-Galactonolacton keine Vorstufe der Ascorbinsäure bei diesen beiden Nesseltieren darstellt. Das entscheidende Enzym der Synthese bei den Wirbeltieren, die Gulonolacton-Oxidase (GLO), katalysiert den letzten Schritt zur Ascorbinsäure. Eine als ci0100132519 bezeichnete cDNA von C. intestinalis weist eine deutliche Ähnlichkeit zum GLO-Gen der Wirbeltiere auf. Diese aus einer Gen-Datenbank stammende cDNA diente als Grundlage für die Entwicklung von Primern. Mit diesen Primern wurden in der vorliegenden Arbeit einige Vertreter der Chordaten, Bryozoen und Echinodermaten untersucht. Jedoch konnten nur zwei entsprechende Sequenzen von C. intestinalis und ein Stück von einer weiteren Tunicate Clavelina lepardiformis gefunden werden. Die Untersuchung von weiteren 17 Arten der Deuterostomier erbrachte kein Ergebnis. Die hohe Differenz der Sequenzen von C. intestinalis aus unterschiedlichen Populationen dieser Art zeigten, dass hier Primer nur für nah verwandte Arten einsetzbar sind. Neben der experimentellen Arbeit wurden verschiedene Gen- Datenbanken mit einer BLAST-Suche auf Sequenzen durchsucht, die Übereinstimmungen zur ci0100132519 aufwiesen. Nur von Ciona savignyi wurde eine Sequenz gefunden und diese wurde zusammen mit ci0100132519 von C. intestinalis und den bekannten GLO-Sequenzen der Wirbeltiere Rattus norvegicus, Mus musculus, Bos taurus, Sus scrofa, Gallus gallus und Scyliorhinus torazame in eine Verwandtschaftsanalyse mit einbezogen. Mit dem Neightborjoining-Verfahren wurden die Daten berechnet und in einem Verwandtschaftsdiagramm dargestellt, das den bisherigen Verwandtschaftshypothesen entsprach. Damit konnte gezeigt werden, dass das GLO-Gen für phylogenetische Analysen geeignet ist Mit dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Ascorbinsäuresynthese innerhalb größerer Einheiten, wie den Vertebraten, auf einen gemeinsamen Ursprung zurückzuführen ist. Diese Fähigkeit ist innerhalb dieser Gruppen mehrfach verloren gegangen. Dadurch ist die Ausgangshypothese erhärtet worden, dass die Ascorbinsäuresynthese als ursprüngliches Merkmal der Metazoa angenommen werden kann.

The evolution of the synthesis of ascorbic acid in the metazoa is not completely revealed yet. Hitherto, the ascorbic acid synthesis was assumed to have evolved repeatedly within different metazoan taxa. But as ascorbic acid is essential for the formation of collagen, the binding element of cells, this study investigated the hypothesis that the ability to synthesize ascorbic acid is a basic characteristic of the metazoa. To test this hypothesis, basal taxa of the metazoa and taxa which are closely related to the vertebrates were examined. In the experimental part, an in vitro enzyme test and a HPLC method for the measurement of the ascorbic acid concentration were established. To validate the results of the enzyme test, a histochemical procedure was conducted by staining the enzyme, which is crucial in the ascorbic acid synthesis. In addition the genetic background of this enzyme was researched. Ascorbic acid synthesis was found in the acrania Branchiostoma lanceolatum. This is the first proof of the ascorbic acid synthesis in the sister group of the vertebrata and thus implies that it can not solely be attributed to the craniota, but has to be considered as being developed earlier. The ascorbic acid synthesis was also found in basal taxa of the metazoa, such as sponges and cnidaria. The cnidaria Alcyonium digitatum, Aiptasia sp., Metridium senile, Sargatiogeton undatus, Thuiaria thuja and the member of the porifera Chondrosia reniformis show the synthesis of ascorbic acid in vitro. Therefore it can be hypotesized that synthesis of ascorbic acid is an original characteristic of all multicellular animals. The positive results of the enzyme test in A. digitatum and M. senile were confirmed by the histochemical method. Additional with this method was the site of this synthesis localized in the gastrodem. No evidence of ascorbic acid synthesis was found in the cordata Ciona intestinalis. However, further experiments are necessary to clarify whether all tunicata are unable to perform the ascorbic acid synthesis or whether C. intestinalis may be an exception. The sponge C. reniformis was able to synthesise ascorbic acid from either L-gulonolacton and L-galactonolacton as a precursor. However, A. digitatum and M. senile were found to specifically use only L-gulonolacton as a precursor. The crucial enzyme in the ascorbic acid synthesis in vertebrates is the gulonolacton oxidase (GLO) that catalyzes the last step in this metabolic pathway. The cDNA with the database name ci0100132519 from C. intestinalis shows high similarity to the GLO gene in vertebrates. This sequence was used to design some primers. The primers were used in the investigation of some chordata, bryozoa and echinodermata whith PCR. However two sequences were only identified in C. intestinalis and additional one sequence in Clavelina lepardiformis. The investigation of another 17 species of the deuterostomia did not give any results. The high difference between individuals of C. intestinalis from different populations showed that primers can only be used in closely related species. Moreover several gene data bases were searched for similarities to the gulonolacton-oxidase-gene with a BLAST search. A sequence of Ciona savignyi was found and compared, together with the sequence of C. intestinalis, to the known GLO-sequences of the vertebrates Rattus norvegicus, Mus musculus, Bos taurus, Sus scrofa, Gallus gallus and Scyliorhinus torazame in a cladistic analysis. The data were assessed by a neighbor joining procedure and presented in a tree. The result corresponds to the current hypotheses. This shows furthermore that the GLO gene is useful in phylogenetic analysis. The recent work shows that ascorbic acid synthesis of larger taxa such as the vertebrates derives from the one origin. The loss of this attribute has repeatedly taken place within groups. The initial hypothesis that the synthesis of ascorbic acid is a basic character of the metazoa can thus be accepted.