Introduction: Limb girdle muscular dystrophy type 2B (Dysferlinopathy, Miyoshi Myopathy) is a hereditary muscular dystrophy caused by mutations in the gene encoding DYSF on chromosome 2p13. Despite the fact that dysferlin was recently predicted to be implicated in muscle membrane repair upon injury, the definitive function leading to the progressive muscular disease still remains a matter of debate. One peculiar aspect delineating dysferlinopathy from other muscular diseases is the late disease onset after puberty and the clinical finding that patients are usually good athletes before that. During adolescence, muscle metabolism undergoes marked changes, switching its fibre type characteristics from a primarily oxidative (type I) to a more glycolytic (type II) metabolism. Considering these aspects, we hypothesized that dysferlin plays a key role in muscle metabolism by influencing glucose uptake and downstream glycolytic pathway. Methods: To elucidate the underlying pathomechanism, we applied GC/MS-based metabolic profiling analysis of dysferlin-deficient human primary myotubes (c.855-1delG;c.895G>A) and dysferlin knockout (B6.A/J-Dysfprmd) mice after i.v. administration of stable isotope labelled 13C6-glucose. Dystrophin-deficient mdx (C57BL/10ScSn- Dmdmdx/J) mice served as a control model for other muscular dystrophies. Alterations in protein expression levels were assessed by LC-MS/MS SILAC-based proteomic analysis. Results: Our GC/MS-based analysis revealed decreased levels of intermediates belonging to the upper glycolytic pathway, whereas metabolites of TCA-cycle associated anaplerotic reactions and fatty acid oxidation were increased in both the cell and mouse model. Metabolic alterations were enhanced in glycolytic type-II muscles. Our LC-MS/MS proteomic analysis confirmed normal metabolic enzyme expression, but we found increased expression of antioxidant enzymes belonging to the thioredoxin/peroxiredoxin family (TRX/PRXS). Furthermore, we detected different isoform expressions of IDH with predominance of IDH2 in oxidative type I muscles and reduction of mitochondrial NAD(P)-transhydrogenase in all muscles of BLA/J mice. Conclusion: Our analysis enabled a unique insight into the metabolic network of a monogenic disease model in vitro and in vivo, thereby revealing a strongly disturbed glucose metabolism in dysferlinopathy pointing towards a reduced glucose uptake. Fuel supply was secured by compensatory upregulation of intermediates associated with an oxidative substrate metabolism. Besides that, different isoform expression of IDH in oxidative and glycolytic muscle fibres combined with decreased NAD(P)-transhydrogenase in dysferlinopathy, could further ameliorate progressive muscle damage. Our study provides a new and so far unknown insight into the metabotype of a very rare monogenic disease model, thus predicting a novel and pivotal function of dysferlin, which opens the field for future research into possible therapeutic interventions.
Einleitung: Die seltene autosomal-rezessiv vererbbare Gliedergürtelmuskeldystrophie Typ 2B (Dysferlinopathie, Miyoshi Myopathie), beruht auf Mutationen des Dysferlin Gens auf Chromosom 2p13, welches das 230kDa große Transmembranprotein Dysferlin kodiert. Die den Pathomechanismus der Dysferlinopathie begründende Funktion von Dysferlin in der Muskelzelle ist bisher unklar, bekannt ist eine Beteiligung von Dysferlin an der Kalzium- abhängigen Vesikelfusion bei Membranreparatur-vorgängen nach Muskelzelltrauma. Ein interessanter klinischer Aspekt der Dysferlinopathie ist die Koinzidenz des physiologischen Shifts des Skelettmuskels von einem kindlichen, primär oxidativen (Typ I Faser), zu einem adulten, zunehmend glykolytischen (Typ II Faser) Substratmetabolismus und dem Eintreten von postpubertären Initialsymptomen einer progressiven Muskeldystrophie. In wie fern eine Dysregulation im zentralen Muskelmetabolismus in Dysferlin-defizienten Muskeln vorkommt und möglicherweise zum Pathomechanismus der progressiven Muskeldystrophie beiträgt, sollte Ziel dieser Studie sein. Methodik: Der zentrale Kohlenstoffmetabolismus von Dysferlin-defizienten humanen primären Myotuben (c.855-1delG;c.895G>A) und Mäusen (B6.A/J-Dysfprmd) wurde mittels Gaschromatographie/ Massenspektrometrie (GC/MS) nach Applikation von 13C markierten stabilen Isotopen im Vergleich zum Wildtyp und einer Dystrophien- defizienten Muskeldystrophiekontrolle (C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J) gemessen. Eine SILAC-basierte Flüssigkeitschromatographie/Tandemmassenspektrometrie (LC- MS/MS) basierte Proteomanalyse erfolgte zur Detektion von veränderten Expressionsmustern Metabolismus-assoziierter Proteine. Ergebnis: Die GC/MS- basierte metabolische Analyse zeigte deutlich verminderte Level an phosphorylierten Hexosen des oberen glykolytischen Pathways, sowie kompensatorisch erhöhte Metabolitlevel anaplerotischer Reaktionen des Citratzyklus und der Fettsäureoxidation in Dysferlin-defizienten humanen Myotuben und BLA/J Mäusen. Dieses metabolische Profil war am stärksten im glykolytischen Typ II Muskeln ausgeprägt. Konkludent mit den Skelettmuskelmetabolitverschiebungen fanden sich erhöhte hepatische Syntheseraten von Ketonkörpern in BLA/J Mäusen. Unsere SILAC-basierte Proteomanalyse ergab normale Expressionsmuster der Glykolyse- und Citratzyklus-assoziierten Enzymkomplexe, wobei Proteine der Thioredoxin/ Peroxiredoxinfamilie (TRX/PRXs) hochreguliert waren. Darüber hinaus fand sich eine muskelfaserspezifische Isoformexpression der Isocitratdehydrogenase (IDH) und eine deutliche Reduktion der mitochondrialen NAD(P)-Transhydrogenase in Dysferlin-defizienten Skelettmuskeln. Schlussfolgerung: Unsere Proteom- und Metabolomanalyse in vivo und in vitro ermöglichte die Aufschlüsselung eines komplexen metabolischen Netzwerkes in einem monogenetischen Krankheitsmodell und die Identifizierung von pathologischen Alterationen in der Glykolyse und dem Citratzyklus. Wir fanden Dysferlin-spezifische, verminderte Level von Intermediaten der oberen Glykolyse – vermutlich durch einen eingeschränkten Glukoseuptake in die Muskelzelle – sowie eine kompensatorische Erhöhung der Fettsäureoxidation und anaplerotischer, Citratzyklus assoziierter, Metabolite. Darüber hinaus konnten wir zeigen dass Dysferlindefizienz erhöhten oxidativen Stress in der Zelle bedingt und die Kombination aus muskelspezifischer IDH Isoform Expression zusammen mit deutlich reduzierter mitochondrialer NAD(P)-Transhydrogenase zur weiteren Muskelzellschädigung beitragen kann. Unsere GC/MS- und LC-MS/MS-basierte Analyse erbrachte neue Ergebnisse auf dem Weg zur Entschlüsselung des Pathomechanismus einer seltenen, bislang noch nicht vollständig verstandenen Erkrankung und legt damit einen Grundstein für weitere molekularbiologische Forschung und potentielle therapeutische Ansätze zur Verlangsamung der progressiven Muskelzellschädigung.
