Maligne Lymphome sind die dritthäufigste Neoplasie und der häufigste Tumor des hämatopoetischen Systems des Hundes. Das biologische Verhalten caniner maligner Lymphome histomorphologisch vorherzusagen ist schwierig, und die derzeit verwendeten Klassifikationen sind kompliziert in ihrer Anwendung und haben nur geringe prognostische Signifikanz. Neue Methoden werden deshalb benötigt, um unkomplizierte, prognostisch orientierte Klassifikationen zu entwickeln. Dabei hat die Rolle der Proliferationsaktivität besondere Aufmerksamkeit erlangt. Das Ziel dieser Studie war die Bewertung der klinischen Beurteilung, der histomorphologischen Klassifizierung, des Immunophänotyps und verschiedener Proliferationsmarker, insbesondere AgNORs, für die Prognose caniner maligner Lymphome in behandelten und unbehandelten Hunden, wobei der Versuch unternommen werden sollte, eine prognostisch aussagekräftige Klassifikation zu erarbeiten. Es wurden 122 periphere Lymphknotenbioptate von 122 Hunden mit malignem Lymphom histologisch und immunhistologisch untersucht. Nach erfolgter Biopsie waren 87 der untersuchten Hunde mit Chemotherapie nach einem standardisierten Protokoll (Vincristin, Cyclophosphamid, Prednisolon, Doxorubicin und L-Asparaginase) behandelt worden, wogegen 35 Hunde unbehandelt blieben. Das Alter, das Geschlecht, die Masse, das klinische Stadium, der histomorphologische Malignitätsgrad (Kiel-Klassifikation, Working Formulation), der Immunophänotyp (T-Zell-Marker CD3 und B-Zell-Marker CD79a) und die Zellproliferation (Ki-67, PCNA, Mitoserate und AgNORs) wurden auf ihre prognostische Bedeutung analysiert. Die AgNORs wurden sowohl qualitativ als auch quantitativ mit und ohne Hilfe der Mikroskopbildanalyse bewertet. Alle Marker wurden an routinemäßig formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe eingesetzt. Als Überlebensparameter wurden die Reaktion des Tumors auf die Behandlung, die krankheitsfreie Überlebenszeit und die Überlebenszeit für behandelte Hunde und die Überlebenszeit für unbehandelte Hunde erfaßt. Die prognostische Signifikanz der zuvor beschriebenen Parameter für die Überlebenszeit und die krankheitsfreie Überlebenszeit von behandelten Hunden wurde mittels univariater (74 Hunde) und multivariater (53 Hunde) Überlebensanalyse ("multivariate logistic regression analysis based on the Cox proportional hazard model regression method with a forward step selection") untersucht. Unbehandelte Hunde wurden aus Vergleichsgründen untersucht und bedeutende prognostische Kriterien für die Überlebenszeit mittels univariater Überlebensanalyse ("univariate logistic regression analysis based on the Cox proportional hazard model regression method with a forward step selection") bestimmt. Alle Parameter für behandelte Hunde mit P-Werten kleiner 0,3 in der univariaten Analyse wurden mittels multivariater Analyse ausgewertet. Ein P-Wert (Irrtumswahrscheinlichkeit) von 0,05 wurde als signifikant erachtet. Das Alter, das Geschlecht, die Masse, das klinische Stadium und der histomorphologische Malignitätsgrad (Kiel-Klassifikation, Working Formulation) hatten keine prognostische Bedeutung für die Überlebenszeit von unbehandelten Hunden und für die Überlebenszeit und die krankheitsfreie Überlebenszeit von behandelten Hunden mit malignem Lymphom. Die Mitoserate war prognostisch nicht signifikant für die Überlebenszeit von unbehandelten Hunden, während die Proliferationsmarker Ki-67 (P = 0,001) und PCNA (P = 0,001) nur prognostisch signifikant für einzelne Gruppen von Hunden waren. Eine ähnliche Bedeutung hatten der maximale Abstand zwischen zwei AgNORs (MAXDIST, P = 0,025) und die maximale AgNOR-Fläche (MAXNOR, P = 0,026). Prognostisch bedeutsame Parameter für die Überlebenszeit von unbehandelten Hunden mit malignem Lymphom waren die durchschnittliche AgNOR-Anzahl (NORNBC, P = 0,001), die durchschnittliche AgNOR-Fläche (MEANAR, P = 0,001), die Lage der AgNORs im Zellkern (LOCAT, P = 0,048), die Anzahl randständiger AgNORs (BORDER, P = 0.027) und der AgNOR-Typ (P = 0,004). Allerdings wurden diese Angaben nur mit der univariaten Überlebensanalyse ermittelt. Bei der Bewertung der Überlebenszeit von behandelten Hunden mit malignem Lymphom waren der Immunophänotyp (P = 0,027), die durchschnittliche AgNOR- Fläche (MEANAR, P = 0,001), der maximale Abstand zwischen zwei AgNORs (MAXDIST, P = 0,009), das Verhältnis zwischen der AgNOR-Summenfläche und der Zellkernfläche (AR_RAT, P = 0,008) und die AgNOR-Summenfläche (S_AREA, P = 0,003) prognostisch signifikant in der multivariaten Analyse, wobei die AgNOR- Summenfläche (S_AREA, P = 0,003) nur eine prognostische Bedeutung für die Überlebenszeit von einzelnen Gruppen behandelter Hunde mit malignem Lymphom hatte. Mitoserate (P = 0,028), PCNA (P = 0,009), Ki-67 (P = 0,087), durchschnittliche AgNOR-Anzahl (NORNBC, P < 0,001), maximale AgNOR-Fläche (MAXNOR, P = 0,001), Lage der AgNORs im Zellkern (LOCAT, P = 0,019) und AgNOR- Typ (P = 0,008) hatten nur in der univariaten Analyse eine prognostische Bedeutung für die Überlebenszeit von einzelnen Gruppen behandelter Hunde mit malignem Lymphom. Die durchschnittliche AgNOR-Anzahl (NORNBC, P = 0,001), die durchschnittliche AgNOR-Fläche (MEANAR, P = 0,001), die AgNOR-Summenfläche (S_AREA, P = 0,001) und die maximale AgNOR-Fläche (MAXNOR, P = 0,01) waren prognostisch signifikant für die krankheitsfreie Überlebenszeit in der multivariaten Analyse, wobei sich die durchschnittliche AgNOR-Anzahl (NORNBC, P = 0,001) als prognostisch wichtigster Parameter herausstellte. Mitoserate (P = 0,02) und AgNOR-Typ (P = 0,012) hatten nur in der univariaten Analyse eine prognostische Bedeutung für die krankheitsfreie Überlebenszeit von einzelnen Gruppen behandelter Hunde mit malignem Lymphom. Der Immunophänotyp und AgNORs sind die wichtigsten prognostischen Marker für die Behandlung caniner maligner Lymphome. Eine längere Überlebenszeit behandelter Hunde mit malignem Lymphom korrelierte mit Lymphomen vom B-Zell- Typ, einer größeren durchschnittlichen AgNOR-Fläche, einem kleineren Abstand zwischen zwei AgNORs und einem kleineren Verhältnis zwischen der AgNOR- Summenfläche und der Zellkernfläche. Eine längere krankheitsfreie Überlebenszeit korrelierte mit einer kleineren AgNOR-Anzahl pro Zellkern. Der Immunophänotyp, die durchschnittliche AgNOR-Fläche (MEANAR) und die durchschnittliche AgNOR-Anzahl (NORNBC) waren die am leichtesten erfaßbaren und prognostisch bedeutensten Parameter. Schon unter Einsatz dieser drei Parameter ist eine Trennung zwischen Risikohunden mit niedrigen Überlebenschancen und Hunden mit Überlebenszeiten von bis zu drei Jahren unter Einsatz von Chemotherapie möglich. Die Erfassung weiterer AgNOR-Parameter würde zwar einer genaueren prognostischen Klassifizierung dienen, setzt jedoch die Benutzung entsprechender Computersoftware voraus und dürfte somit für viele kleinere Laboratorien einen zu hohen Kostenaufwand darstellen. Neben der Erfassung quantitativer AgNOR-Parameter stellen deshalb Verteilungsmuster von AgNORs einen einfachen und nützlichen diagnostischen Parameter zur Indikation der Überlebenszeit dar. Die hier vorgeschlagene Klassifikation basierend auf dem AgNOR-Typ hatte nur in der univariaten Analyse eine prognostische Bedeutung für die Überlebenszeit unbehandelter Hunde mit malignem Lymphom und für die krankheitsfreie Überlebenszeit und die Überlebenszeit von einzelnen Gruppen behandelter Hunde mit malignem Lymphom. Allerdings waren das Verhältnis zwischen der AgNOR-Summenfläche und der Zellkernfläche (AR_RAT) und der maximale Abstand zwischen zwei AgNORs (MAXDIST) wichtige prognostische Faktoren für die krankheitsfreie Überlebenszeit behandelter Hunde mit malignem Lymphom. Das Verteilungsmuster von AgNORs sollte weitergehend unter besonderer Berücksichtigung dieser beiden Parameter untersucht werden, um ein Klassifikationsschema für die prognostischer Bewertung caniner maligner Lymphome zu entwickeln. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt bietet die hier vorgeschlagene AgNOR-Typenklassifikation, gekoppelt mit der Bestimmung des Immunophänotyp und der AgNOR-Anzahl, das schnellste, kostengünstigste und akkurateste Verfahren zur prognostischen Analyse caniner maligner Lymphome. Die Bedeutung prognostischer Marker wird erst mit der Verwendung von Chemotherapie deutlich, da die Überlebenszeiten behandelter Hunde wesentlich länger waren, als die Überlebenszeiten unbehandelter Hunde. Überlebenszeiten von durchschnittlich nur zwei Monaten von unbehandelten Hunden mit malignem Lymphom, eine frühzeitige Euthanasie nach Diagnosestellung und eine kleine Untersuchungsanzahl verhinderten eine multivariate Analyse für unbehandelte Hunde mit malignem Lymphom und lassen die Resultate der univariaten Analyse nur indikativ erscheinen. Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen die Möglichkeit und den Nutzen einer prognostischen Bewertung caniner maligner Lymphome. Ein entscheidender Gesichtspunkt ist hierbei die Verwendbarkeit von routinemäßig formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe zur prognostischen Analyse. Derartiges Material kann ohne größeren Zeit- und Kostenaufwand in der tierärztlichen Praxis gewonnen und entweder weiterverarbeitet oder verschickt werden.
Malignant lymphomas are the third most common canine neoplasm and the most common tumour of the hematopoetic system in dogs. The biological behaviour of canine malignant lymphomas is difficult to predict on the basis of histomorphology alone. Recent classifications are complicated and have only minor prognostic value. Therefore, new methods are necessary to develop a simple, prognostic classification. In this regard, the role of proliferate activity has received special attention. The aim of this study was to investigate the prognostic importance of age, sex, clinical stage, histomorphology, immunophenotype and different proliferation markers, especially AgNORs, for the evaluation of canine malignant lymphomas in treated and untreated dogs and to develop a prognostic useful classification. Peripheral lymph node biopsies from 122 dogs with malignant lymphoma were evaluated microscopically and immunohistochemically. The extirpated lymph nodes from 87 dogs were studied prior to chemotherapy with a standardised protocol (vincristine, cyclophosphamide, prednisolone, doxorubicin and L-asparaginase). The other 35 dogs did not receive chemotherapy. Age, sex, weight, tumor stage, histomorphological grade (Kiel classification, Working Formulation), immunophenotype (using markers for CD 3 and CD 79a) and cell proliferation (Ki-67, PCNA, mitotic index and AgNORs) were evaluated as indicators of prognosis. The AgNORs were assessed qualitatively and quantitatively using also image analysis. All markers were used on routinely formalin fixed, paraffin embedded tissues. Survival measurements, e.g. tumour response, disease free survival time and survival time for treated dogs and survival time only for untreated dogs were compared to the prognostic criteria. Correlations were determined by univariate (74 dogs) and multivariate (53 dogs) logistic regression analysis based on the Cox proportional hazard model regression method with a forward step selection for treated dogs only. Untreated dogs were used as a comparison and important prognostic criteria for the total survival time were determined by univariate logistic regression analysis based on the Cox proportional hazard regression method with a forward step selection. All parameters with P-values less than 0.3 in the univariate analysis were included in the multivariate analysis for treated dogs only. A P-value of 0.05 was considered significant. Age, sex, weight, tumour stage and histomorphological grade (Kiel classification, Working Formulation) had no prognostic significance for the survival time of untreated dogs and for the survival time and disease free survival time of treated dogs with malignant lymphoma. The mitotic index was not significant for the prognosis of survival time of untreated dogs, where as the proliferation marker Ki-67 (P = 0.001) and PCNA (P = 0.001) were only significant for the prognosis of survival for single groups of untreated dogs with malignant lymphoma. The maximal distance between two AgNORs (MAXDIST, P = 0.025) and the maximal AgNOR area (MAXNOR, P = 0.026) had a similar importance. Mean AgNOR number (NORNBC, P = 0.001), mean AgNOR area (MEANAR, P = 0.001), AgNOR location (LOCAT, P = 0.048), number of peripherally located AgNORs (BORDER, P = 0.027) and AgNOR type (P = 0.004) were valuable prognostic markers for the survival time of untreated dogs with malignant lymphoma. However, these results are based on the univariate survival analysis only. In the multivariate analysis immunophenotype (P = 0.027), mean AgNOR area (MEANAR, P = 0.001), maximal distance between two AgNORs (MAXDIST, P = 0.009), ratio AgNOR area/nucleus (AR_RAT, P = 0.008) and total AgNOR area (S_AREA, P = 0.003) were of prognostic significance for the total survival time of treated dogs with malignant lymphoma. However, the total AgNOR area (S_AREA, P = 0.003) was only significant for the prognosis of survival for single groups of treated dogs with malignant lymphoma. Mitotic index (P = 0.028), PCNA (P = 0.009), Ki-67 (P = 0,087), mean AgNOR number (NORNBC, P < 0,001), maximal AgNOR area (MAXNOR, P = 0.001), AgNOR location (LOCAT, P = 0.019), and AgNOR type (P = 0.008) were only significant for the prognosis of survival for single groups of treated dogs with malignant lymphoma in the univariate analysis. Mean AgNOR number (NORNBC, P = 0.001), mean AgNOR area (MEANAR, P = 0.001), total AgNOR area (S_AREA, P = 0.001) and maximal AgNOR area (MAXNOR, P = 0.01) were significant in the multivariate analysis for the prognosis of disease free survival of treated dogs with malignant lymphoma. The mean AgNOR number (NORNBC, P = 0.001) was the most valuable prognostic marker for the disease free survival time. Mitotic index (P = 0.02) and AgNOR type (P = 0.012) were only significant in the univariate analysis for the prognosis of disease free survival for single groups of treated dogs with malignant lymphoma. Immunophenotype and AgNORs were the most important prognostic markers for the treatment of canine malignant lymphomas. Longer survival time of treated dogs with malignant lymphoma correlated with B-cell type lymphomas, a larger mean AgNOR area, a shorter distance between two AgNORs, and a smaller ratio AgNOR area/nucleus. Longer disease free survival time correlated with a smaller mean AgNOR number per nucleus. The immunophenotype, the mean AgNOR number (NORNBC) and the mean AgNOR area (MEANAR) were the most simple to evaluate and prognostically most important of all investigated parameters. The use of these three parameters only allows to separate high risk dogs with a low change of survival from dogs with possible survival times of up to three years, if treated with chemotherapy. The evaluation of additional AgNOR parameters would increase the accuracy of the prognostic classification, however the necessary computer equipment might present a too high of a cost factor for many small animal veterinary practices. In addition to a quantitative AgNOR analysis, AgNOR pattern distribution is a useful and simple diagnostic tool in predicting survival time. The here proposed classification based on AgNOR types had only in the univariate analysis prognostic value for the survival time of untreated dogs and for the disease free survival time and survival time of single groups of treated dogs with malignant lymphoma. In contrast the maximal distance between two AgNORs (MAXDIST) and the ratio AgNOR area/nucleus (AR_RAT) were important prognostic factors for the disease free survival time of treated dogs with malignant lymphoma. AgNOR pattern distribution should be further investigated with special reference to these two parameters to develop a classification for the prognostic evaluation of canine malignant lymphomas. At this point of time the here proposed AgNOR type classification combined with the evaluation of the immunophenotype and the mean AgNOR number is the fastest, most accurate and easiest to afford method for the prognostic evaluation of canine malignant lymphomas. The value of prognostic markers becomes clear with the use of chemotherapy due to longer survival times of treated dogs compared to untreated dogs. Survival times of approximately 2 months only for untreated dogs with malignant lymphoma, early euthanasia after diagnosis and a small total number of cases prevented a multivariate survival analysis and permitted only indicative results with the univariate survival analysis. The results of this work proof the possibility and importance of a prognostic evaluation of canine malignant lymphomas. An important issue is the use of all markers for a prognostic analysis on routinely formalin fixed, paraffin embedded tissues. Such material may be collected and processed or submitted for further evaluation in any small animal veterinary practice without significant additional costs and time efforts.