Deciphering the way σS-containing RNA polymerase (EσS) targets its promoters in Escherichia coli

Abstract

Different environmental stimuli cause bacteria to exchange the sigma subunit in the RNA polymerase (RNAP) and, thereby, tune their gene expression according to the newly emerging needs. Sigma factors are usually thought to recognise clearly distinguishable promoter DNA determinants. However, the case seems to be different for the housekeeping sigma factor in Escherichia coli, σ70 (RpoD) and σS (RpoS), the principle sigma factor in stationary phase and in stressful conditions. These two sigma factors show a high degree of sequence similarity and were found to bind favourably to almost identical -35 and -10 elements in-vitro. Nevertheless, the two sigma factors have clearly different regulons in-vivo, being responsible together for the regulation of more than 90% of the entire genome. The answer to the σS promoter selectivity paradox has puzzled researchers for a long period and only recently has started to being elucidated. A combination of cis-encoded and trans-acting features allows promoter discrimination to be generated between Eσ70 and EσS.

First, by using several natural and synthetic promoters, I was able to show an implication of the UP-element in Eσ70/EσS competition for promoters carrying canonical 10 and 35 elements. Only EσS was shown to use efficiently the distal UP-element sub-site, whereas full UP-elements or proximal UP-element half-sites favoured Eσ70-mediated transcription, provided that a -35 box was co-present. By genetic analysis this differential behaviour of the two RNAPs was attributed to an inability of σS to interact with an adjacently placed αCTD. In contrast, such a direct interaction between αCTD and σ70 is known to stimulate transcription.

Furthermore, a new alignment of 80 experimentally determined σS-dependent promoters indicated that many of them do possess a -35 element, in contradiction to the current belief, but the majority has it misplaced by 1-2bp. Thus, EσS does not show the rigid preference of Eσ70 for 17bp spacers between the -10 and -35 hexamers. These misplaced -35 elements were found to be functional in many cases. In addition, the high conservation of longer or shorter spacers than 17 bp in σS-dependent genes was due to the σS promoter selectivity that these deviations conferred. Finally, the distinctive structural flexibility of EσS in recognising misplaced 35 elements was shown to be due to a different interaction of its region 4 with the β flap subunit of RNAP and/or due to the unique way EσS binds to the extended 10 promoter region.

Apart from the intrinsic cis-acting features that generate promoter selectivity, it is quite frequent that promoters gain their selectivity only with the aid of additional transcriptional regulators. In the case of proP (P2), Fis acts as a class II transcriptional regulator and co-activates the promoter with E σS. It could be demonstrated that the selective EσS-Fis synergy on this promoter is due to the fact that Fis binds at position -41 and sterically forces RNAP to operate with a 16bp-spaced promoter; this requirement can be successfully met by EσS, but not by Eσ70. In addition, the molecular outer face of the domain 4 of σS is better suited for interacting with Fis.

But even before σS competes with σ70 for promoter recognition, one of its main problems, and that of other alternative sigmas, is to out-compete the vegetative σ70 from core RNAP. Crl was shown here to directly help σS compete with σ70 for limiting amounts of core RNAP, both in-vivo and in-vitro, by supporting EσS formation. In addition, a microarray analysis could confine the role of Crl in stationary phase to that of an auxiliary factor of σS, especially when the latter was present in lower cellular amounts. Finally, the pathways enabling Crl to exert a dual role in the regulation of σS levels and activity were identified.

To conclude, this thesis aimed to characterise the function of different cis- and trans-acting elements that support the major stress response sigma factor, σS, to control its substantial regulon (up to 10% of the entire genome). In order to achieve that, σS has to harshly compete with the housekeeping sigma, both for limited amounts of core RNAP, but also for recognition of almost identical core promoter sequences.

Unterschiedliche Umweltstimuli veranlassen Bakterien dazu, die Sigma- Untereinheit in der RNA-Polymerase (RNAP) auszutauschen und dadurch ihre Genexpression auf die neu aufkommenden Bedürfnisse einzustellen. Normalerweise gilt, dass unterschiedliche Sigmafaktoren klar unterscheidbare Promotor-DNA Determinanten erkennen. Im Fall des vegetative Sigmafaktors in Escherichia coli, σ70 (RpoD) und σS(RpoS), dem Hauptsigmafaktor in der Stationärphase und unter Stressbedingungen verhält es sich jedoch anders. Diese beiden Sigmafaktoren zeigen ein hohes Maß an Sequenzähnlichkeit und binden bevorzugt an fast identische -35 und -10 Elemente in vitro. Dennoch haben die beiden Sigmafaktoren in vivo klar unterscheidbare Regulons und sind dabei gemeinsam für die Regulation von mehr als 90% des gesamten Genoms verantwortlich. Die Lösung des σS\- Promotor-Selektivitäts Paradoxes beschäftigt Forscher bereits seit langer Zeit und erst kürzlich ist es gelungen, ihr näher zu kommen. Eine Kombination von in cis oder in trans wirkende Eigenschaften ermöglicht die Unterscheidung von Promotoren durch Eσ70 und EσS.

Erstens konnte ich durch die Verwendung von mehreren natürlichen und synthetischen Promotoren eine Beteiligung des UP-Elements am Wettbewerb von Eσ70 und EσS um Promotoren mit kanonischen -10 und -35 Elementen etablieren. Nur EσS kann die distale Halbeseite des UP-Elements effizient nutzen, während vollständige UP-Elemente oder proximale UP-Element Halbseiten Eσ70-vermittelte Transkription begünstigen, vorausgesetzt, dass gleichzeitig eine -35 Box vorhanden ist. Genetische Analysen konnten dieses unterschiedliche Verhalten der zwei Holoenzyme darauf zurückführen, dass σS unfähig ist, mit einer benachbart platzierten αCTD zu interagieren. Im Gegensatz dazu ist bekannt, dass eine polare Interaktion zwischen der αCTD und σ70 die Transkription stimuliert.

Des Weiteren wies ein Alignment von 80 experimentell bestimmten σS-abhängigen Promotoren darauf hin, dass viele dieser Promotoren, im Widerspruch zu derzeitigen Annahmen, ein -35 Element besitzen. Die Mehrzahl der Promotoren trägt dieses jedoch um 1-2bp versetzt . Daher zeigt EσS nicht die rigide Präferenz, die Eσ70 für 17bp-Spacer besitzt. Diese versetzten -35 Elemente sind in vielen Fällen funktionsfähig. Außerdem war die starke Konservierung von Spacern, die länger oder kürzer als 17 bp sind, in σS-abhängigen Genen auf die σS-Promotor-Selektivität zurückzuführen, die diese Abweichungen bewirkten. Schließlich konnte gezeigt werden, dass die spezifische strukturelle Flexibilität von EσS bei der Erkennung von versetzten -35 Elementen auf einer unterschiedlichen Interaktion der Region 4 von σS mit der β-Flap- Untereinheit der RNAP und/oder auf der unterschiedlichen Art und Weise, wie EσS an die erweiterte -10 Promotorregion bindet, beruht.

Abgesehen von den intrinsischen in cis wirkenden Faktoren, die Promotor- Selektivität bewirken, erhalten Promotoren relativ häufig ihre Selektivität nur durch die Funktion von zusätzlichen transkriptionalen Regulatoren. Im Fall von proP (P2) agiert Fis als ein Klasse II transkriptionaler Regulator und co- aktiviert den Promotor zusammen mit EσS. Wir konnten zeigen, dass die selektive EσS-Fis-Synergie an diesem Promotor darauf zurückzuführen ist, dass Fis an Position -41 bindet und RNAP sterisch dazu zwingt, mit einem 16bp- Spacer zu interagieren. Diese Vorraussetzung kann erfolgreich von EσS, jedoch nicht von Eσ70 erfüllt werden. Zudem ist die nach außen gerichtete Oberfläche von σS von vornherein besser für eine Interaktion mit Fis geeignet.

Doch noch bevor σS mit σ70 um die Promotor-Erkennung konkurriert ist eins seiner Hauptprobleme erfolgreich mit dem vegetativen σ70 um die Kern-RNAP zu konkurrieren. Hier wurde gezeigt, dass Crl sowohl in vivo als auch in vitro σS direkt hilft, mit σ70 um die limitierende Menge an Kern-RNAP zu konkurrieren, indem es die Bildung von EσS unterstützt. Außerdem konnten Microarray-Analysen die Rolle von Crl in der Stationärphase auf die eines Hilfsfaktors für σS einschränken, besonders wenn letzterer in niedrigeren zellulären Konzentrationen vorhanden war. Schließlich wurden die Wege identifiziert, die es Crl ermöglichen, eine doppelte Rolle in der Regulation von σS-Spiegeln und -Aktivität auszuüben.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass es das Ziel meiner Dissertation war, die Funktion verschiedener in cis und in trans wirkender Elemente zu charakterisieren, die den Hauptsigmafaktor der Stressantwort σS dabei unterstützen, sein umfangreiches Regulon (bis zu 10% des gesamten Genoms) zu aktivieren. Dafür muss σS hart mit dem vegetative Sigmafaktor konkurrieren, sowohl um limitierte Mengen an Kern-RNAP als auch um die Erkennung von fast identischen Kern-Promotor-Sequenzen.