Insights into natural evolution can be gained from in vitro selection studies using RNA molecules (aptamers) that interact with high affinity with their target molecules. Developing an understanding of their binding mechanisms is critical for elucidating their structure-activity relationship. In order to examine the binding mechanisms of RNA aptamers, optimal conditions for in vitro selection were first devised for isolating high-affinity aptamers. Eleven GTP aptamers with affinities spanning three orders of magnitude served as a model system for binding studies. These were isolated by a single in vitro selection experiment. Their structures were further optimized by conducting doped re-selections. Equilibrium dissociation constants were then determined by spinfiltration, methods were developed to determine the fraction of aptamer RNA that is correctly folded, and the informational complexity of each aptamer was calculated using information content as a parameter. Studies of aptamer binding mechanisms with 23 GTP analogs showed that aptamers interacted strongly with the nucleobase region of GTP. Weaker contacts with the sugar region were observed, and only a few aptamers interacted with the phosphate region. Neither the number of contacts that an aptamer makes with its target nor the strength of the interactions appeared to have a major effect on aptamer performance. Aptamer size, free energy of secondary structure formation, RNA fraction correctly folded and information content are correlated however and thus crucial for achieving high-affinity binding. By examining a variety of different aptamer parameters, important insights could be gained into aptamer binding mechanisms. Results of these experiments confirmed that the stability of the correctly folded aptamer and of the complex formed with GTP are the key factors for aptamer affinity.
Durch in-vitro-Selektionsstudien mit RNA-Molekuelen (Aptameren), die mit hoher Affinitaet an ihr jeweiliges Zielmolekuel binden, lassen sich Einblicke in den natuerlichen Evolutionsprozess gewinnen. Darueber hinaus leistet ein detailliertes Verstaendnis ihrer Bindungsmechanismen einen wichtigen Beitrag dazu, die Beziehung zwischen Struktur und Aktivitaet von Aptameren zu erforschen. Zur Untersuchung der Aptamer-Bindungsmechanismen wurden zunaechst optimale Bedingungen fuer in-vitro-Selektions-Experimente erarbeitet, um Aptamere mit hoher Bindungsaffinitaet zu isolieren. Elf GTP-Aptamere mit Bindungskonstanten, die ueber drei Groessenordnungen reichen, dienten als Modellsystem fuer Bindungsstudien. Diese wurden in einer einzigen in-vitro- Selektion isoliert und ihre Strukturen durch Reselektion optimiert. Ihre Gleichgewichts-Bindungskonstanten wurden mittles Spinfiltrierung gemessen und Methoden zur Bestimmung des Anteils von korrekt gefalteter RNA entwickelt. Als Parameter zur Berechnung der informationellen Komplexitaet eines jeden Aptamers wurde ihr Informationsgehalt verwendet. Aptamer-Bindungsstudien mit 23 GTP-Analoga zeigten, dass Aptamere am staerksten mit der Basenregion von GTP interagieren. Schwaechere Kontakte wurden in der Zuckerregion beobachtet, waehrend nur wenige Aptamere mit der Phosphatregion interagieren. Weder Intensitaet noch Anzahl der Kontakte, die ein Aptamer mit seinem Zielmolekuel eingeht, haben Einfluss auf die Funktionalitaet eines Aptamers. Groesse, freie Faltungsenergie der Sekundaerstruktur, Anteil der korrekt gefalteten RNA und Informationsgehalt eines jeden Aptamers korrelieren jedoch miteinander und sind von wesentlicher Bedeutung fuer die Bindungsfestigkeit von Aptameren. Analysen einer Reihe unterschiedlicher Aptamer-Parameter lieferten wichtige Einblicke in die Bindungsmechanismen von Aptameren. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestaetigen, dass die Stabilitaet des Komplexes, der von der korrekt gefalteten Aptamer-RNA und dem Komplex mit GTP gebildet wird, der entscheidende Faktor fuer die Bindungsstaerke eines Aptamers ist.
