Wenn kleine Molekülfragmente an Biomakromoleküle binden, können Sie mitunter als Ausgangspunkt für die Wirkstoffentwicklung dienen. Meist ist es jedoch schwierig, diese Bindung zu detektieren, da die Fragmente nur eine geringe Affinität zu ihrem Bindungspartner haben. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung einer Methode für den Fragment-basierten Aufbau von irreversiblen Inhibitoren auf einer Proteinoberfläche. Das aktive Zentrum einer Protease dient dabei als Schablone, in der einerseits eine dynamische Fragmentligation und andererseits eine kovalente Reaktion einer Fragment- bindenden Sonde mit dem katalytisch aktiven Nukleophil des Proteins abläuft. Die daraus resultierende Deaktivierung des Enzyms kann über den verminderten Substratumsatz spektroskopisch nachvollzogen werden, was eine Identifizierung der aktiven Fragmente ermöglicht. Diese Methode wurde für die West-Nil-Virus NS2B/NS3 Protease sowie die Coxsackie-Virus B3 3C Protease etabliert, welche beide pharmakologisch relevante Ziele darstellen, für die aber noch keine geeigneten Therapeutika vorliegen. Die Arbeit gliedert sich in drei Teilbereiche. Der zentrale Ansatzpunkt der vorgestellten Methode war die Verwendung biselektrophiler Sonden, welche sich aus einer Aldehydgruppe für die dynamische Ligation von nukleophilen Fragmenten und einer weiteren elektrophilen Gruppe für die Reaktion mit dem katalytisch aktiven Nukleophil der Protease zusammensetzen. Die drei entwickelten Sonden sind ein Chlormethylketon, ein a,b-ungesättigter Ester sowie ein Epoxid und unterscheiden sich in Aufbau und Inhibitionsmechanismus. Eine Sonde konnte käuflich erworben werden, die anderen beiden wurden synthetisiert. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Sonden genutzt, um ein günstig bindendes Aminfragment zu finden, welches die inhibitorische Aktivität der eingesetzten Sonde verstärkt. Dazu wurde eine Fragmentbibliothek aus 850 primären Aminen in einem Fluoreszenz-basierten Assay untersucht, wobei für jede Sonde je ein aktives Fragment identifiziert werden konnte.Im dritten Teil wurden die aktiven Fragmente mit Hilfe von massenspektrometrischen Untersuchungen verifiziert und mit Docking-Studien nachvollzogen. Eine kovalente Verknüpfung der aktiven Kombinationen und eine anschließende extensive strukturelle Optimierung lieferten eine Reihe Inhibitoren, wobei die potentesten davon für die Coxsackie- Virus B3 3C Protease gewonnen werden konnten. Die Inhibitoren wurden spektroskopisch charakterisiert und die entsprechenden kinetischen Kenngrößen bestimmt. Darüber hinaus gelang es, die zelluläre Wirksamkeit von drei Inhibitoren zu untersuchen sowie den Bindungsmodus eines Inhibitors mit Hilfe einer Röntgenkristallstruktur aufzuklären. Ein in vitro Proteolyse- Aktivitätsassay mit verschiedenen viralen Proteasen zeigte, dass mit Hilfe der hier vorgestellten Methode potente, nicht-peptidische Breitspektrum- Inhibitoren entwickelt werden können.
If small molecular fragments bind to biological macromolecules, they can sometimes serve as a starting point for drug development. The binding is usually difficult to detect since the fragments show only low affinity for their respective binding partner. The work presented here describes the development of a method for the fragment-based organization of irreversible inhibitors on a protein surface. The active site of a protease serves as a template, catalysing a dynamic fragment ligation on the one hand and a covalent reaction of the fragment binding probe with the catalytically active nucleophile of the protein on the other. The resulting deactivation of the enzyme can be traced via fluorescence spectroscopy, which allows for identification of the active fragments. The method was established for the West Nile Virus NS2B/NS3 protease and the Coxsackievirus B3 3C protease, which are both pharmacologically relevant targets, but for which there are no appropriate therapies available yet. The work is divided into three sections. The central starting point of the presented method was the use of biselectrophilic probes which composed of an aldehyde group for dynamic ligation of nucleophilic fragments and another electrophilic group to react with the catalytically active nucleophile of the protease. The three developed probes are a chloromethyl ketone, an a,b-unsaturated ester and an epoxide and they differ in structure and mechanism of inhibition. One probe could be purchased, the other two were synthesized. In the second part, the probes were used to find a low-binding amine fragment which enhanced the inhibitory activity of the probes. For this purpose, a fragment library of 850 primary amines has been screened in a fluorescence-based assay, where one active fragment could be identified for each probe respectively. In the third part the active fragments were verified by means of mass spectrometry and followed with docking studies. Covalent linkage of the active combinations and subsequent extensive structural optimization delivered a set of inhibitors. The most potent ones have been developed for the Coxsackievirus B3 3C protease. Inhibitors were characterized by spectroscopic means and the corresponding kinetic parameters have been determined. Moreover, it was possible to investigate the cellular efficacy of three inhibitors and to clarify the binding mode of one inhibitor using an X-ray crystal structure of the inhibitor-protease complex. An in vitro proteolysis activity assay with different viral proteases showed that non-peptidic broad-spectrum inhibitors can be developed using the method presented here.
