Eps15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate 15)-homology domain containing proteins (EHDs) comprise a family of dynamin-related mechano- chemical ATPases involved in cellular membrane trafficking. EHD proteins consist of a dynamin-related GTPase domain, a helical domain and a C-terminal Eps15-homology (EH) domain,. Previous studies have revealed the structure of the EHD2 dimer. Furthermore, the N terminal region of EHD2 was demonstrated to bind to a hydrophobic groove of the GTPase domain and to switch into the membrane in the presence of liposome, suggesting an autoinhibitory role However, the molecular mechanisms of membrane binding, oligomerization and nucleotide hydrolysis have remained obscure. To understand the mechanism of membrane recruitment, the crystal structure of an aminoterminally truncated EHD4 dimer in complex with ATPγS and ADP were determined in this thesis. Compared with the EHD2 structure, the helical domains assume an open conformation featuring a 50° rotation relative to the GTPase domain. Using electron paramagnetic spin resonance (EPR), it was shown that the opening aligns the two membrane-binding regions in the helical domain toward the lipid bilayer, allowing membrane interaction. A loop region in the GTPase domain undergoes a large rearrangement and creates a new interface that allows oligomerization on membranes. These results suggest that the EHD4 structures represent the active EHD conformation, whereas the EHD2 structure is autoinhibited. A model for the activation and oligomerization of EHD proteins was proposed in which a series of domain rearrangements control membrane recruitment and remodeling in the EHD family. A comparison with other peripheral membrane proteins elucidated common and specific features of this activation mechanism.
Epidermal growth factor receptor pathway substrate 15-homology domain containing proteins (EHDs) sind mechano-chemische ATPasen, die zur Familie der Dynamine gehören und eine wichtige Rolle im Membrantransport spielen. EHD Proteine bestehen aus einer einer Dynaminverwandten GTPase Domäne, einer helikalen Domäne und einer C-terminalen Eps15-homology (EH) Domäne. Die Kristallstruktur des EHD2-Dimer war zu Beginn dieser Studie bekannt und zeigte die allgemeine Architektur von EHD Proteinen auf. Vorhergehende Studien konnten ausserdem zeigen, dass die N-terminale Region von EHD2 in eine hydrophobe Furche der GTPase-Domäne bindet und in der Anwesenheit von Liposomen in die Membran wechselt. Der genaue Mechanismus der Membranbindung und Oligomerisierung, und die spezifische Role der Nukleotid-Bindung für diese Prozesse waren jedoch unklar. Es konnte gezeigt werden, dass die N-terminale Region von EHD2 in eine hydrophobe Furche der GTPase-Domäne bindet. In der Anwesenheit von Liposomen, allerdings, wird diese Region an die Membran dirigiert. Außerdem ist EHD2 ohne N-terminale Region verstärkt in Caveolae vertreten. Um die membranabhängige Aktivierung von EHDs zu verstehen, wurde in dieser Arbeit die Kristallstrukturen eines N-terminal verkürzten EHD4-Konstrukts im Komplex mit ATPγS und ADP bestimmt. Im Vergleich zur EHD2 Struktur sind die helikalen Domänen von EHD4 in einer offenen Konformation und um 50° relativ zur GTPase Domäne gedreht. Mit Hilfe von Elektronenspinresonanz Experimenten konnte gezeigt werden, dass diese Konformationsänderung die membranbindenden Regionen der helikalen Domänen mit der Lipiddoppelschicht aligniert und somit die Membraninteraktion ermöglicht. Weiterhin wird durch die Umorientierung einer Schleife in der GTPase Domäne eine neue Interaktionsfläche gebildet, die zur Oligomerisierung von EHD4 an Membranen beiträgt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die gelösten EHD4 Strukturen die aktive EHD Konformation repräsentieren, während die EHD2 Struktur eine auto-inhibierte Variante aufzeigt. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde ein Modell für die Aktivierung und Oligomerisierung von EHD Proteinen vorgeschlagen, in welchem mehrere Umlagerungen von Domänen für die membranbindung und –remodellierung verantwortlich sind. Ein Vergleich mit anderen peripheren Membranproteinen zeigt Gemeinsamkeiten und Unterschiede dieses Aktivierungsmechanismus auf.
