Protein-Protein-Interaktionen im Zweikomponenten-Signalsystem von Arabidopsis thaliana.

Abstract

Die Cytokininsignaltransduktion konnte bislang aufgrund der Redundanz der beteiligten ZKS-Proteine nur modellhaft aufgeklärt werden. Hinweise zur Regulation dieses Signaltransduktionsweges und zu den Funktionen der ZKS- Proteine sollte die Generierung eines Proteininteraktionsnetzwerkes liefern. In einem Matrix-Ansatz, bei dem mittels des Yeast Two-Hybrid Systems 20 ZKS- Baits gegen 25 ZKS-Preys im Rastermuster auf Protein-Protein-Interaktionen untersucht wurden, wurden unter den 500 Kombinationen insgesamt 68 Interaktionen, 43 neue und 25 bekannte, identifiziert. Die wichtigste Erkenntnis, die mittels des Matrix-Ansatzes gemacht werden konnte, ist, dass ZKS-Proteine derselben Proteinfamilie ein fast identisches Interaktionsmuster zeigen, was auf molekularer Ebene die funktionelle Redundanz innerhalb des ZKS erklärt. Interaktionen zwischen den cytoplasmatischen Domänen der Cytokininrezeptoren (AHK2-AHK2, AHK3-AHK2 und AHK3-AHK4) weisen auf mögliche Homo- und Heterodimerisierungen hin. Weitere ungewöhnliche Interaktionen unter den Typ-B ARRs (ARR14-ARR14, ARR14-ARR2) sowie eine direkte Interaktion zwischen einem Rezeptor und einem Responseregulator (AHK2-ARR14) weisen auf mögliche neue Mechanismen der Cytokininsignaltransduktion hin. Die Qualität des verwendeten Yeast Two-Hybrid Systems wurde durch einen in vitro Interaktionstest belegt, da 38 der insgesamt 42 getesteten neuen Interaktionen verifiziert wurden. Mutations- und Kartierungsanalysen der Interaktionsdomänen ausgewählter ZKS-Proteine lieferten wichtige Hinweise auf die den Interaktionen zugrunde liegenden Mechanismen. AHP5-Mutationsanalysen zeigten stellvertretend für alle AHPs, dass die identifizierten AHP-Interaktionen von ihrem Phosphorylierungszustand unabhängig sind. Mittels einer Domänenkartierung von AHK2 konnte zum einen die komplette Transmitter-Domäne als Interaktionsdomäne für die Homodimerisierung von AHK2, sowie die C-terminale Receiver-Domäne als Interaktionsdomäne für die Interaktion mit AHP5 und ARR14 identifiziert werden. Die Kartierungsanalyse für AHP5 zeigte, dass ihre HPt-Domäne nicht weiter unterteilt werden kann, da dies zum Interaktionsverlust führte. Entgegen bisherigen Behauptungen, dass für die Interaktion mit AHPs die Receiver-Domäne der Typ-B Responseregulatoren benötigt wird, konnte für ARR14 gezeigt werden, dass für die Interaktion mit AHP5 sowie mit AHK2 das komplette ARR14-Protein benötigt wird. Darüber hinaus konnte für die isolierte Output-Domäne von ARR14, wie für andere Typ-B Responseregulatoren auch, eine transkriptionsaktivierende Eigenschaft nachgewiesen werden. Diese Domäne wird ausserdem für die Selbstinteraktion und für die Interaktion mit ARR2 benötigt. ARR4, ein Typ-A ARR, benötigt für ihre Interaktionen das komplette Protein und ist somit auch auf die C-terminale Verlängerung angewiesen. Aufgrund der funktionellen Redundanz innerhalb des ZKS, lag die Vermutung nahe, dass die Signalspezifität möglicherweise hauptsächlich durch Interaktionen der ZKS-Proteine mit anderen Proteinen gesteuert werden könnte. 17 ZKS-Proteine wurden daher mittels der Library- Screens, die gleichzeitig durch Koloniehybridisierung, Erhöhung der Transformationsraten und Änderung des Prey-Vektors optimiert wurden, auf Interaktionen mit anderen Arabidopsis-Proteinen untersucht. Aus 80 Screens wurde ein Interaktionsnetzwerk aus 140 verschiedenen Interaktionen generiert. Alle untersuchten ZKS-Proteine zeigten bekannte und/oder neue Interaktionspartner, die in verschiedenen Prozessen beteiligt sind. Für die Cytokininrezeptoren wurden verhältnismäßig wenige Interaktionen mit AHPs, jedoch zahlreiche mit anderen Proteinen identifiziert. Für die Typ-B sowie Typ-A Responseregulatoren hingegen wurden viele Interaktionen mit AHPs und nur wenige mit anderen Proteinen identifiziert. Aus den Screens wurde die Interaktion AHK2-PI4Kβ1 ausgewählt, da diese auf einen potentiellen Crosstalk zwischen der Cytokinin- und Phosphatidylinositolsignaltransduktion hinweist. In einem Spezifitätstest, in dem alle verfügbaren ZKS-Proteine auf Interaktionen mit PI4Kβ1 untersucht wurden, erwies sich die Interaktion mit AHK2 als spezifisch. Dieses Ergebnis unterstützt die Vermutung, dass innerhalb des ZKS cytokininspezifische Antworten durch spezifische Interaktionen der Cytokininrezeptoren mit anderen Proteinen reguliert werden können. Darüber hinaus zeigte die Interaktionskartierung, dass die Receiver-Domäne von AHK2 für die Interaktion mit PI4Kβ1 benötigt wird. Diese Domäne wird gleichzeitig für die Interaktionen mit AHP5 und ARR14 benötigt, so dass verschiedene Proteine entweder um dieselbe Bindestelle in der Receiver-Domäne von AHK2 konkurrieren oder einen Multiproteinkomplex bilden. Für eine weitere Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen und als ein Beginn für die Analyse von Multiproteinkomplexen wurde die Kopplung von Affinitätschromatographie und Massenspektrometrie verwendet. Die cytoplasmatische Domäne von AHK3 wurde modellhaft bearbeitet. Bei diesen Analysen wurden Hinweise auf eine AHK3-Homodimerisierung und die Interaktion von AHK3 mit einem Protein der Dehydrinfamilie erhalten. Die in dieser Arbeit identifizierten Interaktionen geben neue Einblicke in potentielle Funktionen der ZKS-Proteine und weisen darauf hin, dass Interaktionen mit anderen Proteinen wichtig sind, um die Komplexität der Cytokininsignaltransduktion zu verstehen.

While the principal mechanism of the cytokinin signaling pathway has been elucidated, redundancy in the system has made it difficult to understand which of the many components of the two-component system (TCS) interact to control the downstream biological processes. To further investigate the functions of TCS proteins, this study placed them in a comprehensive network of protein interactions. The yeast two-hybrid was used for a matrix assay in which 20 TCS-Baits and 25 TCS-Preys were investigated for interactions in a grid pattern. Among the 500 combinations 43 new and 25 published interactions were identified. Proteins of the same family showed an identical interaction pattern explaining the functional redundancy of the TCS proteins on molecular level. Putative homo- and heterodimerization among the cytokinin receptors were indicated by the interactions of their cytoplasmic parts (AHK2-AHK2, AHK3-AHK2 and AHK3-AHK4). Two cases of interactions of B-type response regulators (ARR14-ARR14, ARR14-ARR2), which are transcription factors and a direct interaction of a receptor with a response regulator (AHK2-ARR14) indicated putative other mechanisms for cytokinin signaling. To evaluate the quality of the data, 42 interactions were tested by in vitro binding experiments and 38 interactions were confirmed. Analysis of AHP5 mutant proteins showed that activation of this protein by phosphorylation at the conserved histidine is not required for its interactions. Additional analysis of AHK2 showed that the histidine kinase domain is required for homodimerization and the receiver domain for interaction with AHP5 and ARR14. Dividing the HPt domain of AHP5 into two parts resulted in loss of interaction. Analysis of ARR14, a B-type response regulator, revealed that the complete protein is required for interaction with AHP5 and AHK2. The isolated output domain of ARR14 is required for self interaction and for interaction with ARR2. At the same time this domain had a transcription activation activity. ARR4, which is an A-type ARR, required the complete protein for interaction. Because of the functional redundancy within the TCS it was thought that signal specificity is regulated mainly through interactions of the TCS proteins with other proteins. For this, 17 TCS-proteins were investigated for interactions by yeast two-hybrid cDNA-library screens. Screens were optimized by colony hybridization and increasing the number of transformands and using another prey vector. The TCS network included 140 physical interactions of which some were known and others new. The cytokinin receptors interacted mostly with other proteins but less with AHPs, whereas B-type and A-type ARRs interacted mostly with AHPs but less with other proteins. An important novel interaction identified in this study was AHK2-PI4Kβ1 indicating a cross talk between the cytokinin- and phosphatidylinositol signaling pathway. Additional analysis, in which PI4Kβ1 was tested for interactions with all TCS- proteins, revealed that the interaction AHK2- PI4Kβ1 is specific and that the receiver domain of AHK2 is required for this interaction. As a beginn for the analysis of multi proteincomplexes and analysis of further protein protein interactions the affinity chromatography and mass spectrometry was used. The cytoplasmic part of AHK3 was used exemplary. This analysis revealed a putative homodimerization of AHK3 and an interaction with a protein of the dehydrin family. Identified interactions in this work give new insights into putative functions of TCS- proteins and indicate that interactions with other proteins are also important in order to understand the cytokinin signalling pathway.