Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) is a known hematopoietic cytokine that promotes proliferation and differentiation of neutrophil progenitors. Since G-CSF is recognized to ameliorate myocardial ischemic injury, it was projected that this effect would translate into stimulating myocardial adaptations similar to the ones promoted by ischemic preconditioning. Accordingly, it was hypothesized that G-CSF stimulates coronary collateral growth (CCG) in a rat model of repetitive episodic ischemia (RI). Groups of animals were subjected to repetitive episodes of 40 sec left anterior descending coronary artery (LAD) occlusion every 20 min for 2h20min, 3 times/day for a total period of 5 days. CCG was deduced from collateral-dependent flow, i.e., flow to LAD dependent-region determined with neutron activated microspheres during occlusion, and expressed as the increase in the ratio between collateral-dependent and normal zone flows from the initial measurement to that of after 5 days of RI. Following RI, G-CSF treatments (100 microg/Kg/day, s.c.) increased CCG (0.47 +/- 0.15 versus vehicle 0.14 +/- 0.06, P<0.01). Surprisingly, G-CSF treatment without RI increased CCG (0.57 +/- 0.18, P<0.01 vs. vehicle) equal to G-CSF + RI. Because redox signalling is known to be critical for CCG and neutrophils are a rich source of NADPH oxidase and reactive oxygen species (ROS), it was further hypothesized that G-CSF stimulates production of ROS. ROS were evaluated by dihydroethidine (DHE) fluorescence, which was injected in the left ventricle (60 μg/kg) during two consecutive episodes of ischemia. DHE fluorescence was double in G-CSF + RI vs. vehicle + RI (P<0.01), and even higher values were found in G-CSF without RI stimulus (P<0.01). Interestingly, immunostaining with a specific neutrophil marker, myeloperoxidase, showed that the DHE signal did not localize in neutrophils but it appeared in cardiac myocytes. To unequivocally determine if G-CSF stimulated ROS production in cardiac myocytes, isolated cardiac myocytes were studied and it was found that the cytokine stimulates the production of ROS and angiogenic factors that are able to promote tube formation in human coronary artery endothelial cells (HCAECs). In addition to affecting neutrophils, G-CSF directly targets cardiac myocytes to produce ROS and angiogenic factors. This direct action of G-CSF in cardiomyocytes shows how this cytokine plays a pivotal role in triggering adaptations of the heart to ischemia including growth of the coronary collaterals.
Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (engl. granulocyte colony- stimulating factor, G-CSF) ist ein bekanntes hämatopoetisches Zytokin, das die Proliferation und Differenzierung neutrophiler Voläuferzellen fördert. Da G-CSF den Verlauf ischämischer Myokardläsionen positiv beeinflussen kann, wurde angenommen, dass dieser Effekt auf der Stimulation myokardialer Anpassungsvorgänge ähnlich jener nach ischämischer Präkonditionierung beruht. Entsprechend wurde die Hypothese aufgestellt, dass G-CSF in einem Modell repetitiver episodischer Ischämie (RI) in der Ratte koronares Kollateralwachstum (engl. coronary collateral growth, CCG) stimulieren würde. Einzelne Versuchstiergruppen wurden dafür repetitiven Episoden einer 40 Sekunden andauernden Okklusion des Ramus interventricularis anterior der linken Koronorarterie (engl. left anterior descending coronary artery, LAD) ausgesetzt, die für eine Dauer von insgesamt 5 Tagen drei mal pro Tag für 2h 20min alle 20 Minuten wiederholt wurden. CCG wurde dann vom von Kollateralen abhängigen Blutfluss, d.h. vom mit Hilfe von Neutronen-aktivierten- Mikrosphären bestimmten Blutfluss im Strombahngebiet der LAD während der Okklusion, hergeleitet und als Steigerung des Verhältnisses der Durchblutung zwischen LAD- und nichtokkludierten Strombahngebieten von der ursprünglichen Messung zu der Messung 5 Tage nach RI ausgedrückt. Unter RI führte die Gabe von G-CSF (100 microg/kg/d, s.c.) zu gesteigertem CCG (0.47 +/- 0.15 versus Vehikel 0.14 +/- 0.06, P<0.01). Überaschenderweise steigerte G-CSF ohne RI das CCG (0.57 +/- 0.18, P<0.01 vs. Vehikel) wie G-CSF + RI. Da neutrophile Granulozyten reichlich NADPH Oxidase und reaktive Sauerstoffspezies (engl. reactive oxygen species, ROS) enthalten und letztere für das Kollateralwachstum essentiell sind, wurde weiter angenommen, dass G-CSF die Bildung von ROS stimuliert. Das Vorhandensein von ROS wurde dafür anhand der Fluoreszenz von Dihydroethidin (DHE) überprüft, welches während zwei konsekutiver ischämischer Episoden in den linken Ventrikel injiziert wurde. DHE-Fluoreszenz war doppelt so stark in G-CSF + RI gegenüber Vehikel + RI (P<0.01), und sogar noch höhere Werte wurden für G-CSF ohne RI gemessen (P<0.01). Interessanterweise zeigten Immunfärbungen mit Myeloperoxidase als spezifischem Neutrophilen-Marker, dass das DHE Signal nicht in Neutrophilen, dafür aber in Kardiomyozyten lokalisiert war. Um eindeutig festzustellen, ob G-CSF die ROS-Produktion in Kardiomyozyten stimuliert, studierten wir isolierte Kardiomyozyten und fanden heraus, dass G-CSF die Produktion von ROS und angiogenetischen Faktoren stimuliert, welche ihrerseits die Formation tubulärer Strukturen durch koronare Endothelzellen (engl. human coronary artery endothelial cells, HCAECs) fördern. Neben seinem Effekt auf neutrophile Granulozyten fördert G-CSF also auch direkt die Produktion von ROS und angiogenetischen Faktoren in Kardiomyozyten. Dieser direkte Einfluss von G-CSF auf Kardiomyozyten unterstreicht die entscheidende Rolle dieses Zytokins in der Auslösung adaptiver Mechanismen des Herzmuskels unter Ischämie, einschließlich des Wachstums koronarer Kollateralen.
