Zu den essentiellen Funktionen von Trypanosoma brucei gehört die Anpassung der verschiedenen Lebensstadien an den jeweiligen Wirt. Die Identifikation von Genen, die für die im Menschen vorkommenden Blutbahnform spezifisch sind, ist für die Entwicklung neuer Wirkstoffe gegen die Trypanosomen-Infektion besonders interessant. In dieser Arbeit sind Gene mit differentieller Expression in der Blutbahnform und in der prozyklischen Form von T. brucei durch Repräsentative Differenzanalyse und durch die Anwendung der Microarray- Technologie identifiziert worden. Für die Microarray-Analyse ist ein Microarray aus 20.632 genomischen Fragmenten hergestellt worden. Für die Analyse der Hybridisierungsdaten wurden zunächst die Datenbearbeitung optimiert. Dazu wurde zuerst die Effizienz zweier verschiedener Verfahren für die Normalisierung der Hybridisierungsdaten, Mittelwert-Normalisierung und spotnadelspezifische LOWESS-Normalisierung, verglichen. Nach der Normalisierung wurde die Filterung der Daten durch den Vergleich der Effizienz von Signalintensität und Signal/Hintergrund als Kriterium für die Datenqualität optimiert. Die Akkuratheit und die Präzision der Microarray- Analyse unter Verwendung der optimierten Datenbearbeitungsmethoden wurde validiert. Durch die Anwendung der RDA und der Microarray-Analyse konnten mehrere Gene mit stadienspezifischer Expression in der Blutbahnform und der prozyklischen Form identifiziert werden. Unter diesen Genen fanden sich Homologe zu den Oberflächenantigenen der beiden Formen (PARP und VSG) und mit der Expression der VSG-Gene assoziierte Gene (ESAGs). Neben Genen mit bereits bekannter differentieller Expression wurden außerdem zahlreiche neue Gene gefunden. Durch semiquantitative RT-PCR wurde die stadienspezifische Expression der gefundenen Sequenzen bestätigt.
The adaptation of Trypanosoma brucei to its mammalian and insect hosts is an essential feature of the parasite. The identification of genes that are uniquely expressed in the human form of the parasite is of particular interest for the development of new drugs against the T. brucei infection. In this work, genes that are differentially expressed between the human, bloodstream and the insect procyclic form of T. brucei were identified using representational difference analysis (RDA) and microarray technology. For the microarray analysis, a DNA microarray containing 20,632 genomic fragments was constructed. Furthermore, the processing of the microarray data was optimized. First, the efficiency of two different procedures for data normalization � the mean signal intensities normalization and the normalization through the pingroupwise application of the LOWESS regression were compared. Second, the filtering of the data was optimized by testing the signal intensity and the signal/noise ratio of a spot as a measure for the data quality. Finally, the accuracy and the precision of the data obtained after normalization and filtering was validated. Using microarray analysis and RDA, several genes with differential expression in the bloodstream and the procyclic form were identified. Some of the differentially expressed genes were related to the surface antigens VSG and PARP and to the genes that are associated with the expression of the VSGs in the bloodstream form (ESAGs). Also several novel genes with stage-specific expression were identified. The stage-specific expression of these genes was confirmed by semiquantitative RT-PCR.
