Proteomanalyse des Herzmuskels in Abhaengigkeit des Alters, Geschlechtes, Lebensspannen und genetischer Variabilitaet

Abstract

Das Ziel dieser Arbeit war, durch Proteomanalyse einen Einfluss von Entwicklung, Alter, Geschlecht und genetischer Variabilität sowie der Lebensspanne (bei Mäusestämmen mit unterschiedlicher Lebenserwartung) auf die Proteine des Herzmuskels der Maus nachzuweisen. Die altersspezifische Expression von Proteinen wurde an C57BL/6-Mäusen folgender Lebensphasen studiert: Embryonalphase, Geburtsphase, Postnatalphase und Adultphase. Hierbei konnte eine Vielzahl an Unterschieden in der Proteinexpression zwischen den aufeinanderfolgenden Stadien der jeweiligen Lebensphasen gefunden werden. Die Spotunterschiede waren Änderungen in der Spotintensität und des Spotvolumens (hochreguliert, herunterreguliert, vorhanden, nicht vorhanden). Für die Embryonalphase konnten 37 Proteinspots (1,2 %), für die Geburtsphase 104 Proteinspots (3,4 %), für die Postnatalphase 101 Proteinspots (3,3 %) und für die Adultphase 86 Proteinspots (2,8 %) ausgewertet werden. So waren z.B. 68 Spots der Spotunterschiede in der Geburtsphase hochreguliert, während in der Postnatalphase 60 Spots herunterreguliert waren. Weiterhin konnten in der vorliegenden Studie sechs Isoformen des Peroxiredoxin 2 identifiziert werden. Verschiedene Literaturstellen ermöglichten eine Assoziation der sechs Isoformen mit einer oxidativen Modifikation. Drei der Isoformen traten ausschließlich in der Embryonalphase bis einschließlich dem Zeitpunkt der Geburt auf. Dies belegte die wichtige antioxidative Funktion des Peroxiredoxin 2 gegenüber ROS in der Embryonalphase bis einschließlich dem Zeitpunkt der Geburt. Die Untersuchung von geschlechtsspezifischen Proteinspots wurde an C57BL/6 und DBA/2-Mäusen durchgeführt. Geschlechtsspezifische Proteinspots ergaben sich folgendermaßen: C57BL/6, 29 Spots; DBA/2, 20 Spots. Für die C57BL/6-Mäuse wurden geschlechtsspezifischen Proteinspots identifiziert. Dabei waren von den männlichen Proteinmustern vier Proteine Apolipoproteine, die teilweise mehrgliedrig auftraten. ApoJ (3 Spots), ApoA2 (2 Spots) und ApoE traten ausschließlich in den männlichen Tieren auf. ApoA4 (3 Spots) war in den männlichen Tieren stark hochreguliert. Weiterhin konnten drei Proteinpots des Alpha1- Antitrypsins (1-1,1-3,1-5) sowohl als geschlechtsspezifisch als auch altersspezifisch in den C57BL/6-Mäusen festgestellt werden. Das geschlechts- und altersspezifische Verhalten wurde mit den facettenreichen Funktionen des Alpha1- Antitrypsins assoziiert. Ein weiteres Untersuchungsziel war der Einfluss der genetischen Varianz. Hierbei konnten 160 Proteinpolymorphismen zwischen den Mausspezies Mus musculus und Mus spretus (14. Woche) ermittelt werden. In einem letzten Experiment sollte der Einfluss unterschiedlich langer Lebensspannen (Lebenserwartung: DBA/1J, 60 Wochen; DBA/2, 100 Wochen) auf die Proteine ermittelt werden. Zwischen den beiden Mäusestämmen zeigten sich insgesamt 31 Spotunterschiede. Ein in seiner Intensität und Volumen auffälliger Proteinspot, der als Spotunterschied ermittelt wurde, konnte als Proteingemisch aus NADH-Dehydrogenase und NADH-Oxidoreduktase in den DBA/1J- Tieren (60 Wochen) identifiziert werden. Die Proteine stellen Quellen für die Bildung von freien reaktiven Sauerstoffspezies dar. Somit ergab sich ein Zusammenhang zwischen dem Alterungsprozess und dem vermehrten Auftreten von reaktiven Sauerstoffspezies zwischen diesen beiden Mäusestämmen mit unterschiedlich langen Lebensspannen. Die Arbeit hat gezeigt, dass die Proteomanalyse durch die Darstellung von Tausenden von Proteinen erlaubt, Proteine zu entdecken, die in Prozessen wie Alterung und Geschlechtsdifferenzierung eine kritische Rolle spielen. Dies bildet eine Grundlage für aufbauende Untersuchungen im Hinblick auf die Aufklärung von alters- und geschlechtsspezifischen Auftreten von Krankheiten sowie pathologischen Mechanismen.

The aim of this work was the proteomic analysis of the heart to characterize the influence of development, age, sex, genetic variance and senescence (two mice strains with different life spans) on protein patterns of mice. The age specific protein expression was studied throughout the whole life span of C57BL/6 mice, including embryonic, time of birth, postnatal and adult stages. A number of protein spots showed increased/decreased and present/absent profiles throughout these stages. Followingly, spot differences for each stage were characterized: 1. embryonic stage, 37 spots (1, 2 %) 2. time of birth, 104 spots (3, 4 %) 3. postnatal stage, 101 spots (3, 3 %) 3. adult stage, 86 spots (2, 8 %). At the time of birth for example 68 spots showed an increased profile and 60 spots in the postnatal stage showed a decreased profile. Moreover, six spots were identified as peroxiredoxin 2. With help of literature these spots were associated to be oxidatively modified. Three of these spots were only present throughout the embryonic stage until birth. Therefore, a correlation to an important redox regulation against reactive oxygen species (maternal transfer) of peroxiredoxin 2 was associated with the embryonic stagees including the time of birth. The investigations with regards to sex specific protein spots were carried out for protein patterns of C57BL/6 and DBA/2 mice. The following spot differences were observed: C57BL/6, 29 spots; DBA/2, 20 spots. In the protein patterns of male mice four conspicious proteins classified as apolipoproteins. In some cases were detected as a series of spots. ApoJ (3 spots), ApoA2 (2 spots) and ApoE were exclusively observed within male protein patterns. ApoA4 (3 spots) showed an increased appearance in the male mice. Furthermore, three protein spots of Alpha1- Antitrypsin (1-1,1-3,1-5) showed a sex and age specific performance in C57BL/6 mice (14 and 100 weeks). The age and sex specific performance of Alpha1- Antitrypsin was associated with the multifarious functions. In another experiment we examined the influence of genetic variance on protein profiles. We elaborated 160 protein polymorphisms between the two suitable strains Mus musculus and Mus spretus (14 weeks). In the last experiment we investigated the influence of differently life spans on protein patterns. The two mouse strains DBA/2 (100 weeks) and DBA/1J (approximately 60 weeks) were examined. A number of 31 spot changes were observed in this comparative study. A conspicuous intensity and volume of a single spot stuck out in the DBA/1J mice. This increased spot was identified by mass spectrometry as a mix of NADH dehydrogenase and NADH oxidoreductase. Both were a source for reactive oxygen species. Drawing a conclusion, these facts emphasized a relationship between reactive oxygen species and ageing in these mouse strains with different life spans. In general proteome analysis allows separating thousand of proteins. Moreover, it provides the opportunity to find these proteins, which play a critical role in processes like ageing and gender differentiation. These results may be regarded as a foundation for further investigations on the appearance of age and sex specific diseases and pathological mechanisms.