dc.contributor.author
Hadenfeld, Karsten
dc.date.accessioned
2018-06-07T15:08:05Z
dc.date.available
2009-04-03T09:10:21.791Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/613
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-4815
dc.description.abstract
Die RNA-Synthese der Influenza Viren ist ein Schlüsselelement der
Virusreplikation. In der vorliegenden Arbeit konnte das NS2 Protein des
Influenza A Virus als ein Regulatorprotein der viralen RNA Synthese
charakterisiert werden. Die Expression des NS2 Proteins kann die Expression
eines Reportergens durch die virale Polymerase dosisabhängig inhibieren.
Dieser Effekt wurde mittels Northern Blot und Primer Extension Analysen auf
die Inhibition der mRNA-Synthese der viralen Polymerase zurückgeführt.
Gleichzeitig wurde gezeigt, dass die Expression des NS2 Proteins die Synthese
von cRNA und vRNA stimuliert. Eine ansteigende Menge des NS2 Proteins
verringert somit die Transkription viraler Gensegmente in mRNA Moleküle,
während sie zugleich die Replikation dieser Gensegmente durch die virale
Polymerase induziert. In Immunpräzipitationen des NS2 Proteins aus Lysaten
infizierter Zellen konnte die PA Untereinheit der viralen Polymerase
identifiziert werden. Dies ist der erste Hinweis auf eine Interaktion des NS2
Proteins mit dem viralen Polymerasekomplex und diese Interaktion deutet auf
einen möglichen Mechanismus für die Regulatorfunktion des NS2 Proteins hin.
Durch gezielte Mutagenese wurden konservierte Aminosäuren des NS2-Proteins
verändert, um die strukturellen und funktionalen Bereiche für diese Regulation
zu identifizieren. In Reportergenstudien zeigten diese veränderten Proteine im
Vergleich zum WT Protein einen deutlichen Funktionsverlust bezüglich der
Inhibition der Reportergenexpression. Einzige Ausnahme war die Doppelmutation
M5 (R77A/W78A), die diese Funktion kaum beeinträchtigte. Der Funktionsverlust
der Mutanten konnte auf eine fehlende Inhibition der mRNA-Synthese
zurückgeführt werden. Die Interaktion des NS2 Proteins mit dem Matrixprotein
M1, die unter anderem über das betroffene Tryptophan (W78) stattfinden soll,
scheint für die regulatorische Funktion keine tragende Rolle zu spielen. Die
NS2-Mutante M1 (M19T/L21S) zeigte einen deutlichen Funktionsverlust bezüglich
der Inhibition der mRNA Synthese, dagegen war die Stimulation der vRNA
Synthese nicht eingeschränkt. Die beiden regulatorischen Funktionen des NS2
Proteins ließen sich somit durch Mutation separieren, könnten also in
unterschiedlichen Bereichen des NS2 lokalisiert sein. Die Herstellung von
rekombinanten Influenza A Viren, welche die veränderten NS2 Proteine
exprimieren, ermöglichte, die Auswirkung der Mutationen auf die virale
Replikation zu untersuchen. Das Virus mit der Mutation M5 (R77A-W78A) in der
vermutlichen M1-Interaktionsdomäne zeigte in der Regulation der RNA Synthese
keinen Funktionsverlust, war aber in der Replikation im Hühnerei um drei
Größenordnungen gegenüber dem WT attenuiert. Dies zeigt, zusammen mit
Reporterstudien, dass die NS2-M1 Interaktion für die Regulation der RNA
Synthese keine Rolle spielt, im viralen Replikationszyklus jedoch wichtig ist.
Zwei rekombinante Viren mit mutierten NS2 Proteinen konnten trotz mehrerer
Versuche nicht erzeugt werden, M3 (L69S/Q71A) und M6 (L79A/I80A).
Zusammenfassend sei gesagt, dass die hier gezeigte Regulation der viralen RNA
Synthese durch das NS2 Protein ein attraktives Modell darstellt, um die in der
Literatur beobachtete Kinetik der RNA-Synthese des Influenza A Virus während
des Infektionszyklus zu erklären.
de
dc.description.abstract
The RNA synthesis of RNA-viruses is a key factor in replication of these
viruses. While the mechanism of RNA synthesis is well established, its
regulation is still poorly understood. In this study the NS2 protein of an
influenza A virus was characterised as a regulatory factor of viral RNA
synthesis. It was demonstrated, that expression of an Influenza virus-like
reportergene mediated by a recombinant virus polymerase was inhibited by
expression of the NS2 Protein in a dose dependent manner. This effect was
attributed to the inhibition of mRNA synthesis by northern blotting and primer
extension assays. Simultaneously expression of NS2 stimulated synthesis of
viral cRNA and vRNA. So on one hand increasing doses of NS2 protein inhibited
the expression of viral gene segments, while on the other hand these doses
concomitantly stimulated the replication of the same gene segments. To
elucidate the physical mechanisms of this regulation, a search for potential
interactors of NS2 was conducted. Indeed the PA subunit of the viral
polymerase was identified in lysates of infected cells precipitated with an
NS2 antiserum. This is the first evidence of an interaction between NS2 and
the trimeric polymerase complex and illustrates a possible regulating
mechanism. To identify the structural and functional regions that are
important for regulation, conserved amino acids in the NS2 Protein were
changed by site directed mutagenesis. Activity of the mutated proteins was
analyzed by reportergene assays, in which most mutant proteins showed a loss
of function concerning the inhibition of reportergene expression. An exception
was the mutation M5 (R77A-W78A), which hardly affected the regulatory
function. The loss of function was attributed to a deficiency in inhibition of
mRNA synthesis by primer extension assays. The interaction of NS2 and the
matrix protein M1, which is thought to be mediated by the tryptophan on
position 78 (W78) of NS2, seems to be irrelevant for the regulatory function,
since the NS2 Mutant M5 (R77/A-W78A) is not impaired. NS2 Mutant M1
(M19T/L21S) showed a clear loss of function concerning mRNA inhibition, but
was otherwise not impaired in the stimulation of vRNA replication. This shows,
that there are two separate regulatory functions that they might be located in
different regions of the NS2 protein. Production of recombinant influenza A
viruses expressing the mutated proteins described above, facilitated the
investigation of the mutated proteins impact on viral replication. The virus
containing mutation M5 showed no loss of function in RNA synthesis regulation,
but was attenuated by 3 orders of magnitude when compared to the WT Virus.
This demonstrates that the W78 is indeed important for the viral replication
cycle. Even in multiple attempts, viruses carrying mutations M3 (L69S/Q71A)
and M6 (L79A/I80A) in their NS2 Protein could not be rescued. This together
with the strong attenuation of most of the recombinant viruses except M4
(E75A/I76A) and M7 (E82A/V83A), points out the importance of the NS2 protein
in the viral lifecycle. To sum up, new aspects in the regulation of viral RNA
synthesis by the NS2 protein have been characterized in this study. This
regulation of RNA synthesis by the NS2 protein represents an attractive model
to explain the RNA kinetics observed during the replication cycle of influenza
a viruses.
en
dc.format.extent
[4], 106 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Influenza Virus
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::579 Mikroorganismen, Pilze, Algen
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
Analyse der Regulation der RNA Synthese des Influenza A Virus durch das virale
NS2 Protein
dc.contributor.contact
khadenfeld@gmail.com
dc.contributor.firstReferee
Mutzel, Rupert
dc.contributor.furtherReferee
Wolff, Thorsten
dc.date.accepted
2009-03-09
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000009037-2
dc.title.translated
Regulation of RNA synthesis of influenza A virus by the viral NS2 protein
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000009037
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000005285
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access