Die RNA-Synthese der Influenza Viren ist ein Schlüsselelement der Virusreplikation. In der vorliegenden Arbeit konnte das NS2 Protein des Influenza A Virus als ein Regulatorprotein der viralen RNA Synthese charakterisiert werden. Die Expression des NS2 Proteins kann die Expression eines Reportergens durch die virale Polymerase dosisabhängig inhibieren. Dieser Effekt wurde mittels Northern Blot und Primer Extension Analysen auf die Inhibition der mRNA-Synthese der viralen Polymerase zurückgeführt. Gleichzeitig wurde gezeigt, dass die Expression des NS2 Proteins die Synthese von cRNA und vRNA stimuliert. Eine ansteigende Menge des NS2 Proteins verringert somit die Transkription viraler Gensegmente in mRNA Moleküle, während sie zugleich die Replikation dieser Gensegmente durch die virale Polymerase induziert. In Immunpräzipitationen des NS2 Proteins aus Lysaten infizierter Zellen konnte die PA Untereinheit der viralen Polymerase identifiziert werden. Dies ist der erste Hinweis auf eine Interaktion des NS2 Proteins mit dem viralen Polymerasekomplex und diese Interaktion deutet auf einen möglichen Mechanismus für die Regulatorfunktion des NS2 Proteins hin. Durch gezielte Mutagenese wurden konservierte Aminosäuren des NS2-Proteins verändert, um die strukturellen und funktionalen Bereiche für diese Regulation zu identifizieren. In Reportergenstudien zeigten diese veränderten Proteine im Vergleich zum WT Protein einen deutlichen Funktionsverlust bezüglich der Inhibition der Reportergenexpression. Einzige Ausnahme war die Doppelmutation M5 (R77A/W78A), die diese Funktion kaum beeinträchtigte. Der Funktionsverlust der Mutanten konnte auf eine fehlende Inhibition der mRNA-Synthese zurückgeführt werden. Die Interaktion des NS2 Proteins mit dem Matrixprotein M1, die unter anderem über das betroffene Tryptophan (W78) stattfinden soll, scheint für die regulatorische Funktion keine tragende Rolle zu spielen. Die NS2-Mutante M1 (M19T/L21S) zeigte einen deutlichen Funktionsverlust bezüglich der Inhibition der mRNA Synthese, dagegen war die Stimulation der vRNA Synthese nicht eingeschränkt. Die beiden regulatorischen Funktionen des NS2 Proteins ließen sich somit durch Mutation separieren, könnten also in unterschiedlichen Bereichen des NS2 lokalisiert sein. Die Herstellung von rekombinanten Influenza A Viren, welche die veränderten NS2 Proteine exprimieren, ermöglichte, die Auswirkung der Mutationen auf die virale Replikation zu untersuchen. Das Virus mit der Mutation M5 (R77A-W78A) in der vermutlichen M1-Interaktionsdomäne zeigte in der Regulation der RNA Synthese keinen Funktionsverlust, war aber in der Replikation im Hühnerei um drei Größenordnungen gegenüber dem WT attenuiert. Dies zeigt, zusammen mit Reporterstudien, dass die NS2-M1 Interaktion für die Regulation der RNA Synthese keine Rolle spielt, im viralen Replikationszyklus jedoch wichtig ist. Zwei rekombinante Viren mit mutierten NS2 Proteinen konnten trotz mehrerer Versuche nicht erzeugt werden, M3 (L69S/Q71A) und M6 (L79A/I80A). Zusammenfassend sei gesagt, dass die hier gezeigte Regulation der viralen RNA Synthese durch das NS2 Protein ein attraktives Modell darstellt, um die in der Literatur beobachtete Kinetik der RNA-Synthese des Influenza A Virus während des Infektionszyklus zu erklären.
The RNA synthesis of RNA-viruses is a key factor in replication of these viruses. While the mechanism of RNA synthesis is well established, its regulation is still poorly understood. In this study the NS2 protein of an influenza A virus was characterised as a regulatory factor of viral RNA synthesis. It was demonstrated, that expression of an Influenza virus-like reportergene mediated by a recombinant virus polymerase was inhibited by expression of the NS2 Protein in a dose dependent manner. This effect was attributed to the inhibition of mRNA synthesis by northern blotting and primer extension assays. Simultaneously expression of NS2 stimulated synthesis of viral cRNA and vRNA. So on one hand increasing doses of NS2 protein inhibited the expression of viral gene segments, while on the other hand these doses concomitantly stimulated the replication of the same gene segments. To elucidate the physical mechanisms of this regulation, a search for potential interactors of NS2 was conducted. Indeed the PA subunit of the viral polymerase was identified in lysates of infected cells precipitated with an NS2 antiserum. This is the first evidence of an interaction between NS2 and the trimeric polymerase complex and illustrates a possible regulating mechanism. To identify the structural and functional regions that are important for regulation, conserved amino acids in the NS2 Protein were changed by site directed mutagenesis. Activity of the mutated proteins was analyzed by reportergene assays, in which most mutant proteins showed a loss of function concerning the inhibition of reportergene expression. An exception was the mutation M5 (R77A-W78A), which hardly affected the regulatory function. The loss of function was attributed to a deficiency in inhibition of mRNA synthesis by primer extension assays. The interaction of NS2 and the matrix protein M1, which is thought to be mediated by the tryptophan on position 78 (W78) of NS2, seems to be irrelevant for the regulatory function, since the NS2 Mutant M5 (R77/A-W78A) is not impaired. NS2 Mutant M1 (M19T/L21S) showed a clear loss of function concerning mRNA inhibition, but was otherwise not impaired in the stimulation of vRNA replication. This shows, that there are two separate regulatory functions that they might be located in different regions of the NS2 protein. Production of recombinant influenza A viruses expressing the mutated proteins described above, facilitated the investigation of the mutated proteins impact on viral replication. The virus containing mutation M5 showed no loss of function in RNA synthesis regulation, but was attenuated by 3 orders of magnitude when compared to the WT Virus. This demonstrates that the W78 is indeed important for the viral replication cycle. Even in multiple attempts, viruses carrying mutations M3 (L69S/Q71A) and M6 (L79A/I80A) in their NS2 Protein could not be rescued. This together with the strong attenuation of most of the recombinant viruses except M4 (E75A/I76A) and M7 (E82A/V83A), points out the importance of the NS2 protein in the viral lifecycle. To sum up, new aspects in the regulation of viral RNA synthesis by the NS2 protein have been characterized in this study. This regulation of RNA synthesis by the NS2 protein represents an attractive model to explain the RNA kinetics observed during the replication cycle of influenza a viruses.
