Probiotische Futtermittelzusatzstoffe sind in der Tierernährung, insbesondere seit dem europaweiten Verbot von antibiotischen Leistungsförderern im Jahr 2006, von besonderem Interesse. Aufgrund ihrer gesundheits- und leistungsfördernden Eigenschaften werden sie inzwischen häufig in der Nutztierhaltung eingesetzt. Ein häufig postulierter Wirkmechanismus von Probiotika ist die Modulation der Immunantwort im Tier. Im Rahmen dieser Studie wurden daher verschiedene Analysen durchgeführt, um insbesondere die Wirkung des probiotischen Bakteriums Bacillus toyonensis auf die intestinale Immunantwort beim Ferkel zu untersuchen. Dazu wurden in einem Fütterungsversuch insgesamt 40 Ferkel von acht Sauen eingesetzt und in eine Versuchs- und eine Kontrollgruppe aufgeteilt. Die Sauen der Versuchsgruppe erhielten ab dem 90. Tag ante partum bis zum Ende der Säugeperiode B. toyonensis Sporen über das Futter, die Ferkel dieser Gruppe ab dem 14. Lebenstag als Beifutter. Anschließend wurden zu insgesamt vier verschiedenen Zeitpunkten vor und nach dem Absetzen Blut- und Gewebeproben entnommen und für die Untersuchung der intestinalen Integrität, eventueller morphologischen Veränderungen des Epithels, der Entwicklung verschiedener intraepithelialer Lymphozytenpopulationen während des Absetzens sowie für Genexpressionsanalysen verwendet. Es konnten keine durch das Probiotikum beeinflussten gesundheitlichen Merkmale oder veränderte Leistungsparameter innerhalb der ersten drei Lebenswochen beobachtet werden. Es zeigten sich jedoch Veränderungen in der Integrität der intestinalen Barriere. Anhand von Ussing Kammer Versuchen konnte kurze Zeit nach dem Absetzen eine deutlich erhöhte Permeabilität für den Marker Meerrettichperoxidase (HRP) im Jejunumepithel gemessen werden (p ≤ 0,05). Elf Tage nach dem Absetzen war kein Gruppenunterschied mehr messbar. Untersuchungen der Serumproben mittels ELISA zeigten zudem nach dem Absetzen einen erhöhten Sojaprotein-Antikörpertiter innerhalb der Probiotikagruppe, welcher sich elf Tage nach dem Absetzen deutlich von der Kontrollgruppe unterschied (p ≤ 0,03). Der Einsatz des Probiotikums hatte keinen Einfluss auf die Expression von Molekülen der MHC- Klasse-I-Proteinkomplex-Familie durch die Enterozyten. Die in dieser Arbeit untersuchten Stressfaktoren MIC2 und ULBP scheinen somit nicht für die erhöhte Permeabilität der Darmschranke verantwortlich zu sein. Durchflusszytometrische Untersuchungen ergaben kurz nach dem Absetzen eine deutlich geringere Anzahl der Gesamt-Leukozyten im Jejunumepithel der Probiotikagruppe (p ≤ 0,05). Insbesondere die Häufigkeit der intraepithelialen T-Zellen war in der mit dem Probiotikum gefütterten Gruppe niedriger (p ≤ 0,01). Elf Tage nach dem Absetzen zeigte die Probiotikagruppe jedoch ein deutlich erhöhtes Vorkommen der Gesamt-Leukozyten im Vergleich zur Kontrollgruppe (p ≤ 0,05). Dies deutet auf eine verzögerte Entwicklung der intraepithelialen lymphozytären Besiedlung, insbesondere der der spezifischen, adaptiven Immunabwehr, durch den Einsatz des Probiotikums hin. Morphologische Messungen des jejunalen Epithels zeigten deutlich verlängerte Zotten innerhalb der Probiotikagruppe, besonders im Zeitraum vor und kurze Zeit nach dem Absetzen. Die Kryptentiefe scheint dabei von dem Probiotikum unbeeinflusst zu sein. In einem zweiten, Probiotika-unabhängigen Versuchsteil wurde das immunologische Reaktionsverhalten während der kritischen Phase des Absetzens näher untersucht. Von besonderem Interesse war hierbei die Funktion des Natürlichen Killerzellen Rezeptors NKG2D. Dieser ist durch die Bindung von, durch Enterozyten exprimierten, Stressmolekülen dazu in der Lage, infizierte und gestresste Zellen zu erkennen. Mithilfe von MACS Analysen konnte erstmals die Expression des Rezeptors auf intraepithelialen γδ T Zellen des Schweins und somit ihre Fähigkeit zur Kommunikation mit den sie umgebenden Enterozyten gezeigt werden. Mittels Aktivierungsstudien isolierter γδ T Zellen und CD8β T-Zellen konnte zudem ein sich unterscheidendes Expressionsverhalten des Rezeptors auf diesen beiden Lymphozytenpopulationen nachgewiesen werden. Während NKG2D auf den γδ T Zellen konstitutiv exprimiert zu sein scheint, resultiert eine vorherige Aktivierung des TCR/CD3 Komplexes auf den CD8β T-Zellen in einer deutlich erhöhten Rezeptorexpression. NKG2D scheint hier, ähnlich wie beim Menschen, als co stimulierender Rezeptor zu fungieren. Der NKG2D Rezeptor zeigt somit durch die Erkennung von Stressfaktoren sowohl Eigenschaften der angeborenen Immunabwehr, als auch, durch die Abhängigkeit der TCR Aktivität, der adaptiven Immunabwehr. Mithilfe der Daten dieser Arbeit konnten somit neue Hypothesen zur Funktion verschiedener intraepithelialer Lymphozytenpopulationen und ihrer Rolle in der stressinduzierten Immunantwort aufgestellt werden.
Ever since the ban of antibiotic performance enhancers in Europe in 2006, probiotic feed additives are of special interest in the field of animal nutrition. Due to their health and growth promoting features they are commonly used in livestock rearing. One of the frequently discussed effects of probiotics is their potential for immunomodulation in the animal. Thus, the objective of this study was to determine the influence of the probiotic Bacillus toyonensis (ToyoCerin®) on the intestinal immune response in piglets. In a feeding trial 40 piglets from eight sows were assigned to a treatment and a control group. The sows of the treatment group received the B. toyonensis spores as a feed supplement from day 90 ante partum until the end of the suckling period of 28 days. The piglets of the treatment group began receiving the probiotic 14 days after birth. Blood and tissue samples were collected four separate times before and after weaning. The samples were used to evaluate the intestinal integrity and morphological changes of the epithelium, the development of different populations of intraepithelial lymphocytes during the weaning phase, and gene expression analysis. The probiotic supplementation did not have an effect on the health or performance status of the piglets during the first three weeks of life. However, probiotic administration had an impact on the intestinal integrity of the piglets. Ussing chamber analysis revealed a large increase in the permeability of the jejunal epithelium for the marker horseradish peroxidase shortly after weaning compared to the control group (p ≤ 0,05). Eleven days after weaning the difference between treatment and control group was no longer detectable. Furthermore, ELISA analysis of the blood serum samples showed an elevated antibody titer for soy protein in the treatment group as compared to the control animals. This difference was most notable eleven days after weaning (p ≤ 0,03). The supplementation with the probiotic did not affect the expression of the analyzed MHC class I molecules by enterocytes. Consequently, the stress factors MIC2 and ULBP did not appear to be responsible for the enhanced permeability of the intestinal barrier. Flow cytometry analysis revealed a noticeably decreased frequency of lymphocytes in the jejunal epithelium of the treatment group shortly after weaning (p ≤ 0,05). The frequency of intraepithelial T cells was especially reduced in the group that received the probiotic (p ≤ 0,01). However, eleven days after weaning the number of lymphocytes was much higher in the treatment group compared to the control animals (p ≤ 0,05). This indicates that the development of the intraepithelial lymphocytes is delayed when piglets are supplemented with the probiotic, particularly those of the adaptive immune response. Morphological measurements revealed elongated villi in the jejunal epithelium of the piglets from the treatment group, especially during the weaning phase. There was however no detectable influence of the probiotic on crypt depth. In a probiotic- independent study, the immunological response during the crucial weaning phase of the piglets was evaluated in depth. Thereby the function of the natural killer cell receptor NKG2D was of particular interest. By binding stress molecules that are expressed by enterocytes the NKG2D receptor is capable of recognizing infected and stressed cells. The expression of NKG2D was detected via MACS analysis on intraepithelial γδ T cells and their ability to communicate with surrounding enterocytes was shown for the first time in swine. Based on activation studies of isolated γδ T cells and CD8β T cells differential expression patterns of NKG2D were revealed for both lymphocyte populations. Porcine intraepithelial γδ T cells seem to express the receptor constitutively, while the expression is enhanced in CD8β T cells by a previous activation of the TCR/CD3 complex. Therefore NKG2D appears to function as a co-stimulatory receptor on CD8β T cells, as it does in humans. NKG2D shows characteristics from both the innate and adaptive immune response due to its ability to recognize stress factors, and its dependence on TCR activity. The results of this study allowed us to conduct new hypotheses about the function of different intraepithelial lymphocyte populations and their role in the stress induced immune system of piglets.
