dc.contributor.author
Gräler, Markus Herbert
dc.date.accessioned
2018-06-07T19:28:58Z
dc.date.available
2001-01-21T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/6123
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-10322
dc.description
1\. Einführung 1
2\. Material 15
3\. Methoden 25
4\. Ergebnisse 65
5\. Diskussion 115
6\. Zusammenfassung 133
7\. Summary 135
8\. Literatur 137
9\. Abkürzungsverzeichnis 149
10\. Danksagung 153
dc.description.abstract
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß der aus in vitro-
differenzierten humanen und murinen dendritischen Zellen isolierte G-Protein-
gekoppelte Rezeptor EDG6 auf mRNA-Ebene in hämatopoietischen und lymphatischen
Geweben und Zellinien sowie in der Lunge exprimiert wird. Das
Expressionsmuster ist in Mensch und Maus identisch und läßt auf eine mögliche
Funktion des EDG6-Rezeptors im Immunsystem schließen. Das humane edg6-Gen ist
auf Chromosom 19p13.3, das murine Homolog auf Chromosom 10 jeweils hinter dem
Gna15/16-Gen lokalisiert. Auf Proteinebene konnte der humane und der murine
Rezeptor in der richtigen Orientierung auf der Oberfläche EDG6-transfizierter
Zellen nachgewiesen werden. Ferner sind drei monoklonale Antikörper
hergestellt worden, die gegen den N-Terminus des murinen EDG6-Rezeptors
gerichtet sind und deutliche Signale auf transfizierten Zellen zeigen, auf
primären Zellen bislang jedoch keine eindeutigen Ergebnisse liefern.
Die Herstellung verschiedener stabil EDG6 überexprimierender Zellinien
ermöglichte Untersuchungen bezüglich des Liganden sowie der G-Protein Kopplung
und der Signaltransduktion von EDG6. Als ein spezifischer Ligand konnte
Sphingosin-1-phosphat mit der moderaten Bindungskonstante von 63nM ermittelt
werden. Die Stimulierung von EDG6 führt zur Aktivierung von G alpha i- und G
alpha12/13-Untereinheiten trimärer G-Proteine. Über die G alpha
i-Untereinheiten werden anschließend die Mitogen-aktivierten Proteinkinasen
ERK1/2 sowie die Phospholipase C aktiviert. Ferner führt die Stimulierung des
EDG6-Rezeptors zu deutlichen Zytoskelettveränderungen, die sich in einer
erhöhten Anzahl peripherer Streßfasern, abgerundeter Zellen und besonders
langer Filopodien äußern und vermutlich über G alpha 12/13 und Rho-GTPase-
vermittelte intrazelluläre Signalwege induziert werden. Eine gewisse
Pertussistoxin-sensitive und Liganden-unabhängige Basalaktivität des
EDG6-Rezeptors ist in EDG6 überexprimierenden Jurkat-Zellen festzustellen, die
eine deutlich erhöhte Spontanmigration zeigen. Allerdings lassen die
Migrationsexperimente nicht auf eine durch EDG6 induzierte gerichtete
Migration schließen.
Versuche bezüglich der Oberflächenexpression des EDG6-Rezeptors deuten auf
eine komplexe zellspezifische Regulation des Oberflächentransports hin. In
HEK293-Zellen konnte die Internalisierung des EDG6-Rezeptors nach Stimulierung
mit Sphingosin-1-phosphat nachgewiesen werden, während EDG6 in CHO-K1-Zellen
erst Minuten nach Sphingosin-1-phosphat-Stimulierung und in HeLa-Zellen
Minuten nach Zugabe eines unbekannten Hitze-instabilen Serumproteins massiv an
die Zelloberfläche transportiert wird. Diese Regulation scheint von einem
freien EDG6-N-Terminus abhängig zu sein, da N-terminal Epitop markierte
EDG6-Konstrukte nicht mehr dieser differentiellen Oberflächenregulation in
HeLa-Zellen unterliegen und konstitutiv an der Zelloberfläche präsent sind.
Um die in vivo-Funktion des EDG6-Rezeptors näher untersuchen zu können, wurde
ein embryonaler Stammzellklon zur Generierung edg6-defizienter Mäuse
hergestellt. Möglicherweise moduliert EDG6 nach Bindung von freigesetztem
Sphingosin-1-phosphat in autokriner und parakriner Weise die Immunantwort in
Folge einer Stimulierung des Immunsystems, die beispielsweise durch eine
Infektion induziert werden könnte.
de
dc.description.abstract
The present study demonstrates that the G protein-coupled receptor EDG6
isolated from in vitro differentiated human and murine dendritic cells is
expressed in hematopoietic and lymphoid tissues and cell lines as well as in
lung. The mRNA expression pattern is identical in man and mouse and points to
a putative function of the EDG6 receptor in the immune system. The human edg6
gene is encoded on chromosome 19p13.3, the murine homolog on chromosome 10.
Both genes are located upstream of the of the Gna15/16 gene. The human and
murine EDG6 receptors have been detected on the cell surface of transiently
transfected cells in the correct orientation. Furthermore, three monoclonal
antibodies that are directed against the N-terminus of the murine EDG6
receptor have been generated . They show distinct signals on transiently
transfected cell lines, but they lack any specific signal on primary cells so
far.
The generation of stably human EDG6 overexpressing cell lines has enabled the
investigation of the ligand, the G protein-coupling, and the signal
transduction of EDG6. Sphingosine 1-phosphate could be identified as a
specific ligand for EDG6 with a moderate binding constant of 63nM. Stimulation
of EDG6 leads to the activation of G alpha i and G alpha 12/13 subunits of
trimeric G proteins. The mitogen-activated protein-kinases ERK1/2 as well as
the phospholipase C are subsequently activated in a G alpha i-dependent
manner. Moreover, stimulation of the EDG6 receptor leads to distinct
cytoskeleton rearrangements resulting in increasing amounts of peripheral
stress fibers, cell rounding and very long filopodia. These effects are
induced presumably by G alpha 12/13 and Rho GTPase-driven signaling pathways.
A certain pertussis toxin-sensitive and ligand-independent basal activity of
the EDG6 receptor is demonstrable in stably human EDG6 overexpressing Jurkat
cells that show a higher degree of spontaneous migration events. However,
these experiments do not suggest an EDG6-induced migration towards a
sphingosine 1-phosphate stimulus.
Experiments concerning the surface expression of EDG6 indicate a complex cell-
specific regulation of the surface transportation. In HEK293 cells the
internalization of the EDG6 receptor has been shown after stimulation with
sphingosine 1-phosphate. In CHO-K1 cells EDG6 is transported towards the cell
surface only several minutes after stimulation with sphingosine 1-phosphate,
and in HeLa cells the addition of an unknown heat instable serum protein is
critical for the surface transportation of EDG6. The mentioned regulation
seems to be dependent on a free EDG6 N-terminus because N-terminal epitope-
tagged EDG6 constructs lack the differential surface regulation in HeLa cells.
They are constitutively present on the cell surface.
To further investigate the in vivo function of the EDG6 receptor, an embryonic
stem cell clone has been generated to establish edg6-deficient mice. EDG6
possibly modulates the immunological response in an autocrine or paracrine
fashion after binding free sphingosine 1-phosphate. This event may happen
after an immunological challenge like an infection.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
sphingosine 1-phosphate
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Der G-Protein-gekoppelte Rezeptor EDG6
dc.contributor.firstReferee
PD Dr. Martin Lipp
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Udo Heinemann
dc.date.accepted
2001-01-19
dc.date.embargoEnd
2001-01-24
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2001000068
dc.title.translated
The G-protein-coupled receptor EDG6
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000000363
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2001/6/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000000363
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free
dcterms.accessRights.openaire
open access