6\. Zusammenfassung Die im Anschluss an einen Herzinfarkt stattfindende gesteigerte Produktion von extrazellulären Matrixproteinen (EZMP) durch kardiale Fibroblasten (Remodeling) führt im Infarktgebiet zur Entstehung eines Narbengewebes, welches für den Erhalt der strukturellen Integrität des Herzens wichtig ist und z.B. eine Ruptur der Ventrikelwand verhindern kann. Da Remodeling jedoch auch im nicht-infarzierten Gebiet zu beobachten ist und dort zu einer Beeinträchtigung der restlichen Ventrikelfunktion führt, ist das Wissen um Mechanismus und Beeinflussbarkeit von hohem klinischem Stellenwert. Es ist bekannt, dass Angiotensin II eine wichtige Rolle im Remodeling-Prozess spielt. Die Rolle des Wachstumsfaktors TGF-ß1 ist ebenfalls Gegenstand aktueller Untersuchungen. In dieser Dissertation untersuchten wir die Reaktion kardialer Fibroblasten auf Ischämie, auf eine Behandlung mit Angiotensin II und TGF-ß1, vor allem hinsichtlich der Produktion von EZMPs. Zur Durchführung der Versuche wurden Herzen weiblicher Schlachtschweine entnommen und diese im Labor unter normothermen Bedingungen mit verdünntem Eigenblut reperfundiert. Bei den Herzen der Infarktgruppe wurde nach 1 h Adaptationszeit der R. circumflexus für zwei Stunden verschlossen, anschließend wiedereröffnet und das Herz noch für 4 h reperfundiert. Die Herzen der Kontrollgruppe wurden für 7 h perfundiert und keiner Infarzierung unterworfen. Die in dieser Dissertation untersuchten Fibroblasten stammen bei Infarktherzen aus dem infarzierten Gebiet sowie aus den nicht-infarzierten Arealen des linken Ventrikels, bei Kontrollherzen aus dem Bereich des linken Ventrikels. Die Fibroblasten wurden unter Standardzellkultur-Bedingungen angezüchtet. Wir verwendeten zur Analyse die Techniken Durchflusszytometrie, Westernblot, Immunzytochemie und TaqMan-PCR. Ischämie bewirkt bei einem Teil der kardialen Fibroblasten eine Umdifferenzierung in Myofibroblasten. Hinsichtlich der EZMP OPN, Kol I, Kol III, LAM sowie FIB bewirkt Ischämie und Reperfusion eine deutliche Steigerung der Produktion, was wir mittels Durchflusszytometrie, Westernblot, Immunzytochemie und TaqMan-PCR belegen konnten. Auch der Wachstumsfaktor TGF-ß1 wird nach Ischämie vermehrt produziert, wie die Westernblot-Untersuchung zeigt. Eine Behandlung mit Angiotensin II (0,1 µM und 1 µM) führt zu einem dosisabhängigen Anstieg der EZMP-Produktion in kardialen Fibroblasten sowohl aus Infarktherzen als auch aus Kontrollherzen. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit einer Reihe von Untersuchungen, auch an menschlichen kardialen Fibroblasten. TGF-ß1 wurde ebenfalls durch Ang II- Stimulation vermehrt produziert. Um eine mögliche Vermittlerrolle von TGF-ß1 für den Effekt von Ang II zu untersuchen, stimulierten wir Fibroblasten mit TGF-ß1 des Schweins. Es zeigte sich hier ein zeitabhängiger Anstieg der Produktion von Kol III sowie von OPN. Diese Ergebnisse stehen mit anderen Studien im Einklang. Die Ergebnisse der Dissertation zeigen die herausragende Bedeutung kardialer Fibroblasten für das postinfarzielle Remodeling. Zudem weisen die Resultate darauf hin, dass Ang II eine wichtige Funktion bei der Induktion des kardialen Remodelings wahrnimmt und dass es diesen Effekt durch Stimulation der TGF-ß1-Produktion bewirkt. Zudem können wir zum ersten Mal nachweisen, dass das in vivo induzierte Signal zur gesteigerten Produktion von EZMP in vitro beibehalten wird. In künftigen Untersuchungen soll dieser Mechanismus näher untersucht werden sowie die medikamentöse Beeinflussbarkeit der Fibroblasten analysiert werden. Weil die Übereinstimmungen unseres Schweineherzmodells mit Ergebnissen an menschlichen Fibroblasten größer sind, als dies bei Ratten- oder Mäusefibroblasten der Fall ist, könnte unser Modell des isolierten hämoperfundierten ischämischen Schweineherzens in Zukunft als standardisiertes Herzinfarktmodell verwendet werden. Weitere Unter-suchungen müssen durchgeführt werden, um die Ergebnisse dieser Dissertation zu validieren.
The increased production of extracellular matrix proteins (ecmp) through cardiac fibroblasts (remodeling) following cardiac infarction leads to formation of scar tissue in the infarct area. This scar tissue helps to conserve the integrity of the heart and offers protection against a possible rupture of the ventricle. Remodeling is also to be found in non-infarcted regions of the heart, leading to impaired ventricular dysfunction. Therefore, knowledge about the underlying mechanisms of remodeling is of high clinical relevance. It is well known that angiotensin II plays a pivotal role in the remodeling process. The role of TGF-ß1 in the process of remodeling is object of actual investigations. The aim of this study was to analyze the effect of ischaemia and reperfusion, treatment with angiotensin II and TGF-ß1 on isolated cardiac fibroblasts, mainly regarding the production of extracellular matrix proteins. Porcine hearts were obtained from a slaughterhouse and transported to the laboratory within 1h at 4°C. The hearts were prepared and reperfused with own blood under normothermic conditions. After one hour of perfusion, the hearts beat regularly (adaptation time). The hearts of the infarct group underwent infarction by occlusion of the ramus circumflexus of the left coronary artery for 2h, before reperfusion was continued for another 4h. The hearts of the control group were hemoperfused for 7 hours without infarction. We analysed fibroblasts derived from the infarct-area, the non- infarcted area of infarcted hearts and from the left ventricle of control hearts. Fibroblasts were plated in culture flasks and incubated under standard cell culture conditions. Analyses were performed using flow-cytometry, western blot analysis, immunocytochemistry and RT TaqMan PCR. In some of the fibroblasts, ischaemia leads to transdifferentiation into myofibroblasts. Ischaemia and reperfusion leads to an increase in production of the extracellular matrix proteins osteopontin, collagen type I, collagen type III, laminin and fibronectin. The content of the cytokine TGF-ß1 is elevated in cardiac fibroblasts, following ischaemia and reperfusion. Treatment of the cells with angiotensin II (0,1 µM und 1 µM) leads to a dose-dependent increase of production of ecmp in cardiac fibroblasts from infarcted and non-infarcted hearts. These results are in line with a number of studies. Treatment with angiotensin II leads to an increase in TGF-ß1, and TGF-ß1 stimulates the production of Osteopontin and collagen type I and collagen type III in a time- dependent manner. The results of this study show the pivotal role of cardiac fibroblasts in remodeling following cardiac infarction. Our studies strongly suggest that TGF-ß1 is upregulated by Ang II and that TGF-ß1 increases very early synthesis of collagen type I and III, therefore representing a necessary mediator of extracellular matrix remodeling post-MI. Furthermore, our study indicates that the signals delivered to fibroblasts during acute ischaemia can be conserved during subsequent in vitro cell culturing. To our knowledge, such a result has not been previously described. This mechanism has to be analyzed in future studies. The porcine heart bears an analogy to the human heart in anatomy and physiology. Therefore, it can serve as standard infarct model in the future.
