Deciphering Splicing Regulation for TRAF3 Exon 8 Alternative Splicing – CELF2 and hnRNP C Regulate TRAF3 Exon 8 Skipping Upon T Cell Activation

Abstract

T cell activation is accompanied by dramatic changes in gene expression which mediate changes in functionality. These alterations in gene expression depend not only on transcriptional changes but also on alternative splicing. One of the inducible splicing events regulating T cell activation occurs in the TRAF3 gene in which exon 8 skipping increases upon T cell activation. It has already been shown that the full length TRAF3 isoform inhibits the non-canonical NFκB pathway while the short isoform activates this pathway and helps to trigger an immune response. Here, the regulation of TRAF3 exon 8 splicing upon T cell activation was investigated. The cis-acting element was identified with minigenes. It is a sequence of 96 bp, which is located 336 bp upstream of TRAF3 exon 8. An siRNA screen and UV-Crosslink immunoprecipitation experiments identified CELF2 and hnRNP C as two trans-acting factors. UV-Crosslink assays confirmed a direct binding of both proteins to the cis-acting. While binding is antagonistic, both proteins function synergistic in inducing TRAF3 exon 8 skipping. TRAF3 exon 8 splicing induction is cell type-specific since it is missing in Hek cells and human B cells. These cell lines reveal that CELF2 is the driving force because its expression correlates with skipping induction. Ramos and Hek cells do not express CELF2 endogenously and do not induce exon 8 skipping but overexpression of exogenous CELF2 induces exon skipping. In contrast, hnRNP C is needed for exon 8 skipping but its expression is not sufficient. Minigene experiments addressing a putative role of the cis-acting element to the TRAF3 exon 8 revealed that the distance is crucial for the strength of splicing induction. Changing the distance decreases TRAF3ΔE8 formation. The data proposed the following model: In resting T cells, hnRNP C is highly expressed and binds to the cis-acting element. In activated T cells, hnRNP C expression decreases. CELF2 expression increases and binds additionally to the cis-acting element. Binding of both proteins to the cis- acting element induce TRAF3 exon 8 skipping. Furthermore TRAF3 splicing was investigated in the mouse T cell line El4. TRAF3 exon 8 alternative splicing is conserved between both species in resting T cells. In contrast, the splicing-induction of exon 8 skipping upon T cell activation is species- specific because it occurs in human but not in murine T cells. The complete regulatory mechanism needs further investigation but minigene experiments pointed to a trans-driven regulation. This is unusual because most species- specific splicing events are cis-driven regulated.

Es konnte bereits gezeigt werden, dass sowohl Änderungen der Transkription als auch das alternative Spleißen eine wichtige Rolle in der Umgestaltung zellulärer Prozesse während der T Zellaktivierung darstellen. Eines der Gene, dessen alternatives Spleißen sich verändert, heißt TRAF3. Im Gegensatz zu ruhenden T-Zellen, die hauptsächlich die volle Länge TRAF3 Isoform (TRAF3vl) exprimieren, wird in aktivierten T-Zellen TRAF3 Exon 8, zu einem gewissen Prozentsatz, aus der mRNA ausgeschlossen (TRAF3ΔE8). Beide TRAF3 Isoformen übernehmen unterschiedliche Funktionen in T-Zellen. Während TRAF3vl den NFκB- Signalweg in ruhenden T-Zellen inhibiert und somit zur Verhinderung einer Immunabwehr beiträgt, aktiviert TRAF3ΔE8 diesen Signalweg. Obwohl die Funktion beider Isoformen bekannt war, war unklar wie diese Induktion von TRAF3Δ8 reguliert wird. Die Aufklärung des regulatorischen Mechanismus war Gegenstand dieser Arbeit. Mit Hilfe von Minigen-Experimenten konnte eine Sequenz von 96 Basenpaaren identifiziert werden, die für die Regulation wichtig sind (ein sogenanntes „cis-acting element“). Diese Sequenz liegt 336 Basenpaare strangaufwärts von dem alternativ gespleißten Exon 8. Eine Kombination aus siRNA-Screening und UV-Quervernetzungsversuchen, die an eine Immunpräzipitation gekoppelt waren, hat zwei Proteine identifiziert, die direkt an das cis-acting element binden und das Spleißen von TRAF3 regulieren. Sie heißen CELF2 und hnRNP C („trans-acting factors“). Die Versuche haben gezeigt, dass CELF2 und hnRNP C antagonistisch binden. Allerdings regulieren sie beide synergistisch, indem sie einen Exon 8 Ausschluss induzieren. Ein Vergleich von TRAF3 Spleißen in T-Zellen mit dem Spleißen in B-Zellen ergab, dass CELF2 die treibende Kraft für den Exon 8 Ausschluss ist. Dies wurde dadurch gezeigt, dass diese Zellen nach Aktivierung keinen Anstieg in der TRAF3ΔE8 Expression zeigen und das korreliert mit einer fehlenden endogenen CELF2 Expression. Das Einbringen eines CELF2-Plasmides in die B-Zellen konnte TRAF3ΔE8 Produktion induzieren. Im Gegensatz dazu exprimieren beide Zelllinien hnRNP C, dessen Expression nötig, aber nicht ausreichend für den Exon 8 Ausschluss ist. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die Position des cis- acting elements entscheidend ist für die Induktion von TRAF3ΔE8 ist. In Minigen-Versuchen, in denen die Position des cis-acting elements variierte, war die Fähigkeit das Exon 8 auszuschließen deutlich reduziert. Diese Positionsabhängigkeit und die Versuche, die eine Beteiligung von CELF2 und hnRNP C an der Regulation zeigten, führten zum Vorschlag des folgenden Modells: In ruhenden, humanen T-Zellen wird CELF2 nur schwach exprimiert, während hnRNP C in großen Mengen vorhanden ist. In aktivierten T-Zellen, sinkt die hnRNP C Expression. Zusätzlich steigt die Expression an CELF2, das ebenfalls an das cis-acting element bindet. Die Bindung beider Proteine an das cis-acting element induzieren einen Ausschluss von Exon 8.