Genomic alterations, such as point mutations and structural variations are known causes of congenital limb defects in human. The genetic heterogeneity underlying these anomalies requires a genome-wide diagnostic approach. In this thesis we applied the whole exome sequencing (WES) and microarray-based comparative genomic hybridization (array CGH) techniques in a group of patients presenting with different types of limb malformations. The first part of the thesis concerns investigating a missense mutation and a deletion within the Sterile Alpha Motif (SAM) domain of the ZAK gene, that were identified in Pakistani and Tunisian families, respectively. All the affected family members in both pedigrees were presenting with split foot malformation, hearing impairment and nail deformity. We applied the CRISPR/Cas9 system in the mouse embryonic stem cells to generate a ZAK mouse model deficient in the SAM- containing domain of the gene. The obtained mutant showed a complex limb duplication defect. The abnormality was induced by the downregulation on the Tp63 gene. Also, we showed that the ZAK gene was expressed in the heart and limbs in mice and the knockout of both ZAK isoforms via CRISPR/Cas9 genome editing was lethal in transgenic mice. The next section of the thesis concerns an Iranian patient presenting with a severe metacarpal-to-carpal transformation that was subjected to the whole exome sequencing. The patient’s parents were consanguineous and not affected, which strongly indicated to a recessive mode of inheritance. WES analysis revealed a novel homozygous missense mutation c.938C>G (p.313T>R) in the HOXD13 gene. We showed using electrophoretic mobility shift assay (EMSA) that this substitution led to the HOXD13 protein loss of function. The last chapter concerns a cohort of patients presenting with ectrodactyly. In this part, 134 families were subjected to array CGH. Heterozygous microdeletions encompassing two exons of the DYNC1I1 gene, which normally functions as a limb enhancer of the Dlx5/6 genes, on chromosome 7q21.3 were identified. Based on the research described in this thesis we can conclude: 1) the crucial role of ZAK gene in limb deformities, 2) the causative character of the homozygous point mutation in the HOXD13 gene identified in a patient presenting with a severe limb defect, whose healthy parents were carriers of the mutation, 3) the substantial role of deletions in coding extremities enhancer of Dlx5/6 gene on chromosome 7q21.3, which were found in about 3% of all families with limb malformations.
Genetische Veränderungen, wie Punkmutationen und Strukturvarianten, sind als Ursache für angeborene Defekte der Gliedmaßen im Menschen bekannt. Da es sich um ein phänotypisch und genotypisch sehr heterogenes Krankheitsbild handelt, ist es sinnvoll diese Fälle mit genomweiten Analyseverfahren wir der Microarray-basierten komparativen genomischen Hybridisierung (Array CGH) und mittels Exome Sequenzierung zu untersuchen. Im ersten Teil dieser Arbeit habe, habe ich eine homozygote Missens-Mutation und eine überlappende homozygote Deletion in der Sterile Alpha Motif (SAM) Domäne des ZAK Gens identifiziert in einer pakistanischen und einer tunesischen Familie. Beide Familien zeigten Spaltfüße, Nagelverdopplung der Hände und Schwerhörigkeit. Wir konnten mittels in situ Hybridisierung zeigen, dass in der Maus ZAK im embryonalen Herzen und in den Extremitäten exprimieret ist. Der komplette knock out von beiden Isoformen von ZAK mittels CRISPR/Cas genome editing zeigte sich als früh embryonal letal. Die spezifische Deletion der SAM Domäne des ZAK Gens zeigte einen Duplikationsdefekt der Extremitäten, welcher mit einer verminderten Tp63 Expression einherging. Im zweiten Teil der Arbeit habe ich eine Familie aus dem Iran mit einer schweren Form der Synpolydaktylie mittels Exome Sequenzierung untersucht. Wir konnten erstmals eine homozygote Missens- Mutation im HOXD13 Gen als ursächlich für eine schwere Synpolydaktylie nachweisen. Mittels Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) konnten wir weiterhin zeigen, dass es sich um eine Loss of Function Mutation handelt. Im dritten Teil dieser Arbeit habe ich 134 Familien mit Spalthänden und Spaltfüßen mittels Array CGH auf Deletionen und Duplikationen von Chromosom 7q21.3 untersucht. Dort liegt im DYNC1I1 Gen ein bekannter kodierender Extremitäten Enhancer von Dlx5/6. Zusammenfassend habe ich in dieser Arbeit folgende Ergebnisse erzielt: 1) Ich konnte Mutationen und Deletionen von ZAK als molekulare Ursache von Spalthänden identifizieren. 2) Ich konnte zeigen, dass eine homozygote Missens-Mutation im HOXD13 Gen als ursächlich für eine schwere Synpolydaktylie ist. 3) Ich konnte zeigen, dass Deletionen eines kodierenden Extremitäten Enhancers von Dlx5/6 auf Chromosom 7q21.3 in ca. 3% aller Familien mit Spalthänden und Spaltfüßen zu finden sind.
