Die auf Durchflusszytometrie basierende Messung des TCR-Vβ-Repertoires stellt eine etablierte Methode zur Bestimmung von klonalen T-Zell-Expansionen in physiologischen und pathologischen Konditionen dar. Ziel dieser Studie war die Charakterisierung des TCR-Vβ-Repertoires bei verschiedenen T-Zell- Subpopulationen gesunder Probanden und virusspezifischer T-Zelllinien zur adoptiven T-Zelltherapie. Diese wurde mit Hilfe der 10-Farben- Durchflusszytometrie durchgeführt. Darüber hinaus wurden prominente Expansionen mit TCR-Single-Kolonie-Sequenzierung charakterisiert. Für den ersten Teil der Studie wurde das Blut von 66 gesunden Probanden im Alter von 0 (Nabelschnurblut) bis 72 Jahren untersucht. Weiterhin wurden 18 T-Zelllinien zur adoptiven T-Zelltherapie durch die Stimulation mit virusspezifischen Peptiden aus menschlichen PBMC generiert. Das zur Analyse genutzte Panel bestand aus 25 Antikörpern zur Bestimmung von menschlichen TCR-Vβ-Ketten und zusätzlich CD3, CD4, CD8, CD45RA, CCR7, CD25 und CD57. Zur TCR-Single-Kolonie- Sequenzierung wurde mit RNA die cDNA synthetisiert, die spezifischen TCR-Vβ- Familien amplifiziert, in E.coli transformiert, nochmals amplifiziert, aufgereinigt und anschließend sequenziert. Zur statistischen Analyse wurden der Wilcoxon-Test und die Varianzanalyse genutzt. Zu Beginn wurden Expansionen, basierend auf der Analyse der TCR-Vβ-Verteilung, bei CD4+ und CD8+ T-Zellen berechnet. Daraufhin wurden Gating-Strategien zur vertiefenden TCR-Analyse bei naiven, Central-Memory-, Effektor-Memory- und Effektor-T-Zellen etabliert. Insgesamt waren mehr dominante Expansionen bei Effektor-T-Zellen im Gegensatz zu Central-Memory-, Effektor-Memory- oder naiven T-Zellen zu sehen. Beispielsweise waren die höchsten Expansionen bei CD45RA+/CCR7-Effektor-T-Zellen sowohl bei CD4+ (Faktor 8) als auch bei CD8+ (Faktor 11). Es waren jedoch keine Expansionen bei naiven T-Zellen zu finden. Bemerkenswerterweise fanden sich ebenfalls keine Expansionen bei CD4+ Central- Memory- und nur sehr wenige bei CD8+ Central-Memory-T-Zellen (0,5). Weiterhin wurde die Auswirkung des CMV-Serostatus auf die TCR-Klonalität der CD8+ T-Zellen untersucht: Expansionsfaktor 6 versus Expansionsfaktor 1,5 wurden beim Vergleich von CMV-positiven versus CMV-negativen Spendern gemessen. Bei 18 virusspezifischen T-Zelllinien zur adoptiven T-Zelltherapie wurden durchflusszytometrische Daten und TCR-Vβ-Sequenzen korreliert. Im Durchschnitt fanden sich 4,3 TCR-Vβ-Expansionen pro T-Zelllinie bei CD4+ Zellen. Dagegen waren nur 2,4 Expansionen pro T-Zelllinie bei den CD8+ T-Zellen zu sehen. Dieser Unterschied ist hoch signifikant (p = 0,002). Jedoch waren die Expansionswerte nach Zellkultur höher (p < 0,002) bei CD8+ (37,7 %) als bei CD4+ (9,2 %) T-Zellen. Die Expansionszahlen und Expansionswerte zeigten vor der Kultur noch keinen Unterschied zwischen CD4+ und CD8+ T-Zellen. Durch einen Vergleich der Klonotypen vor und nach Expansion konnten neue Erkenntnisse über die Eigenschaften der verschiedenen T-Zelllinien zur adoptiven T-Zelltherapie gewonnen werden. Es zeigte sich, dass die Subpopulationen-Verteilung bei den analysierten T-Zelllinien zur adoptiven T-Zelltherapie, anders als bei der Untersuchung des peripheren Blutes der Probanden, unabhängig von der Klonalität ist. Diese Studie ermöglicht einen Einblick in die in vivo TCR-Vβ-Repertoire-Zusammensetzung der T-Zell- Subpopulationen. Effektor-T-Zellen zeigen ein stark polarisiertes TCR-Vβ- Repertoire und Central-Memory-T-Zellen zeigen überraschenderweise eine eher naiv-ähnliche Verteilung. Die Daten deuten darauf hin, dass die antigenvermittelte Expansion der langlebigen Central-Memory-Zellen polyklonaler ist als jene bei kurzlebigen terminal differenzierten Effektor-T-Zellen. Weiterhin ist festzustellen, dass TCR-Durchflusszytometrie in Kombination mit TCR-Single-Kolonie-Sequenzierung geeignete Methoden darstellen, um klonale Expansionen bei T-Zelllinien zur adoptiven T-Zelltherapie zu zeigen. In weiteren Studien sollte die in vitro und in vivo Effektivität der expandierten Zellen gezeigt werden, um diese mit den Klonotypen korrelieren zu können.
Flowcytometry based analysis of the TCR repertoire is a well established tool for the detection of clonal T-cell expansions in physiologic and pathologic conditions. As no data are available, here was asked for the individual TCR repertoires in T-cell subsets and virus specific adoptive T-cell cultures using 10-color flowcytometry. Furthermore, prominent Vβ expansions were sequenced with TCR single colony sequencing and the results were correlated. First blood of 66 healthy subjects aged 0 (cord blood) to 72 years was analysed. Then 18 adoptive T-cell cultures were generated after peptide specific expansion of human PBMC. For flowcytometry analysis a set of 25 antibodies detecting human TCR Vβ chains in addition to CD3, CD4, CD8, CD45RA, CCR7, CD27, CD57 was employed. For TCR single colony sequencing cDNA was synthesised from RNA, TCR specific Vβ families were amplified, transformed into E.coli, amplified, cleaned and finally sequenced. Statistical analysis included Wilcoxon and analysis of variance. Initially, TCR expansion values were calculated based on the analysis of TCR-Vβ distribution on CD4+ and CD8+ T-cells. Then a gating strategy was established allowing discriminative TCR repertoire analysis of naive, central/effector memory, and effector subsets. Overall, more dominant TCR expansions were present within effector as opposed to central/effector memory or naive cells, e.g. median TCR Vβ expansion rate was highest on CD45RA+/CCR7- effector CD4+ and CD8+ cells (8 and 11 fold, respectively) but absent on naive CD4+ and CD8+ cells. Remarkably, TCR expansions were missing (0) or very low (0.5) on CD4+ and CD8+ central memory population, respectively. The impact of CMV serostatus was also investigated: 6 vs. 1.5 fold expansion rate were encountered in CD8+ cells of CMV-positiv versus CMV-negativ donors. In 18 virus specific T-cell cultures flowcytometry data and sequences were correlated. An average of 4.3 Vβ expansions was identified per cell line in CD4+ cells versus only 2.4 Vβ expansions in CD8+ subset; cross Wilcoxon testing showed highly significant difference (p = 0.002). The values of these expansion were post expansion higher (p < 0.002) on CD8+ (37.7 %) than on CD4+ cells (9.2 %). Values between CD4+ and CD8+ prior to expansion showed no difference. Comparison of sequenced clonotypes and baseline values gives new insights into the properties of the different adoptive T-cell cultures. Effector T-cells show a strongly biased TCR repertoire whereas surprisingly, central memory T-cells show a rather naive- like distribution although they contain enhanced frequencies of antigen- specific T-cells. These data suggest that antigen-driven expansion among long- lived central memory is more polyclonal and in short-lived terminally differentiated effector more oligoclonal. Furthermore, this study shows that TCR flowcytometry in combination with TCR sequencing is a suitable tool to identify clonal expansions in adoptive T-cells. Future studies are underway to explore the in vitro and in vivo killing efficiency of expanded T-cells and to correlate them with clonotypic sequence analysis.
