dc.contributor.author
Bretschneider, Isabell
dc.date.accessioned
2018-06-07T19:12:14Z
dc.date.available
2012-11-28T10:08:15.350Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/5827
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-10026
dc.description.abstract
Die auf Durchflusszytometrie basierende Messung des TCR-Vβ-Repertoires stellt
eine etablierte Methode zur Bestimmung von klonalen T-Zell-Expansionen in
physiologischen und pathologischen Konditionen dar. Ziel dieser Studie war die
Charakterisierung des TCR-Vβ-Repertoires bei verschiedenen T-Zell-
Subpopulationen gesunder Probanden und virusspezifischer T-Zelllinien zur
adoptiven T-Zelltherapie. Diese wurde mit Hilfe der 10-Farben-
Durchflusszytometrie durchgeführt. Darüber hinaus wurden prominente
Expansionen mit TCR-Single-Kolonie-Sequenzierung charakterisiert. Für den
ersten Teil der Studie wurde das Blut von 66 gesunden Probanden im Alter von 0
(Nabelschnurblut) bis 72 Jahren untersucht. Weiterhin wurden 18 T-Zelllinien
zur adoptiven T-Zelltherapie durch die Stimulation mit virusspezifischen
Peptiden aus menschlichen PBMC generiert. Das zur Analyse genutzte Panel
bestand aus 25 Antikörpern zur Bestimmung von menschlichen TCR-Vβ-Ketten und
zusätzlich CD3, CD4, CD8, CD45RA, CCR7, CD25 und CD57. Zur TCR-Single-Kolonie-
Sequenzierung wurde mit RNA die cDNA synthetisiert, die spezifischen TCR-Vβ-
Familien amplifiziert, in E.coli transformiert, nochmals amplifiziert,
aufgereinigt und anschließend sequenziert. Zur statistischen Analyse wurden
der Wilcoxon-Test und die Varianzanalyse genutzt. Zu Beginn wurden
Expansionen, basierend auf der Analyse der TCR-Vβ-Verteilung, bei CD4+ und
CD8+ T-Zellen berechnet. Daraufhin wurden Gating-Strategien zur vertiefenden
TCR-Analyse bei naiven, Central-Memory-, Effektor-Memory- und
Effektor-T-Zellen etabliert. Insgesamt waren mehr dominante Expansionen bei
Effektor-T-Zellen im Gegensatz zu Central-Memory-, Effektor-Memory- oder
naiven T-Zellen zu sehen. Beispielsweise waren die höchsten Expansionen bei
CD45RA+/CCR7-Effektor-T-Zellen sowohl bei CD4+ (Faktor 8) als auch bei CD8+
(Faktor 11). Es waren jedoch keine Expansionen bei naiven T-Zellen zu finden.
Bemerkenswerterweise fanden sich ebenfalls keine Expansionen bei CD4+ Central-
Memory- und nur sehr wenige bei CD8+ Central-Memory-T-Zellen (0,5). Weiterhin
wurde die Auswirkung des CMV-Serostatus auf die TCR-Klonalität der CD8+
T-Zellen untersucht: Expansionsfaktor 6 versus Expansionsfaktor 1,5 wurden
beim Vergleich von CMV-positiven versus CMV-negativen Spendern gemessen. Bei
18 virusspezifischen T-Zelllinien zur adoptiven T-Zelltherapie wurden
durchflusszytometrische Daten und TCR-Vβ-Sequenzen korreliert. Im Durchschnitt
fanden sich 4,3 TCR-Vβ-Expansionen pro T-Zelllinie bei CD4+ Zellen. Dagegen
waren nur 2,4 Expansionen pro T-Zelllinie bei den CD8+ T-Zellen zu sehen.
Dieser Unterschied ist hoch signifikant (p = 0,002). Jedoch waren die
Expansionswerte nach Zellkultur höher (p < 0,002) bei CD8+ (37,7 %) als bei
CD4+ (9,2 %) T-Zellen. Die Expansionszahlen und Expansionswerte zeigten vor
der Kultur noch keinen Unterschied zwischen CD4+ und CD8+ T-Zellen. Durch
einen Vergleich der Klonotypen vor und nach Expansion konnten neue
Erkenntnisse über die Eigenschaften der verschiedenen T-Zelllinien zur
adoptiven T-Zelltherapie gewonnen werden. Es zeigte sich, dass die
Subpopulationen-Verteilung bei den analysierten T-Zelllinien zur adoptiven
T-Zelltherapie, anders als bei der Untersuchung des peripheren Blutes der
Probanden, unabhängig von der Klonalität ist. Diese Studie ermöglicht einen
Einblick in die in vivo TCR-Vβ-Repertoire-Zusammensetzung der T-Zell-
Subpopulationen. Effektor-T-Zellen zeigen ein stark polarisiertes TCR-Vβ-
Repertoire und Central-Memory-T-Zellen zeigen überraschenderweise eine eher
naiv-ähnliche Verteilung. Die Daten deuten darauf hin, dass die
antigenvermittelte Expansion der langlebigen Central-Memory-Zellen
polyklonaler ist als jene bei kurzlebigen terminal differenzierten
Effektor-T-Zellen. Weiterhin ist festzustellen, dass TCR-Durchflusszytometrie
in Kombination mit TCR-Single-Kolonie-Sequenzierung geeignete Methoden
darstellen, um klonale Expansionen bei T-Zelllinien zur adoptiven
T-Zelltherapie zu zeigen. In weiteren Studien sollte die in vitro und in vivo
Effektivität der expandierten Zellen gezeigt werden, um diese mit den
Klonotypen korrelieren zu können.
de
dc.description.abstract
Flowcytometry based analysis of the TCR repertoire is a well established tool
for the detection of clonal T-cell expansions in physiologic and pathologic
conditions. As no data are available, here was asked for the individual TCR
repertoires in T-cell subsets and virus specific adoptive T-cell cultures
using 10-color flowcytometry. Furthermore, prominent Vβ expansions were
sequenced with TCR single colony sequencing and the results were correlated.
First blood of 66 healthy subjects aged 0 (cord blood) to 72 years was
analysed. Then 18 adoptive T-cell cultures were generated after peptide
specific expansion of human PBMC. For flowcytometry analysis a set of 25
antibodies detecting human TCR Vβ chains in addition to CD3, CD4, CD8, CD45RA,
CCR7, CD27, CD57 was employed. For TCR single colony sequencing cDNA was
synthesised from RNA, TCR specific Vβ families were amplified, transformed
into E.coli, amplified, cleaned and finally sequenced. Statistical analysis
included Wilcoxon and analysis of variance. Initially, TCR expansion values
were calculated based on the analysis of TCR-Vβ distribution on CD4+ and CD8+
T-cells. Then a gating strategy was established allowing discriminative TCR
repertoire analysis of naive, central/effector memory, and effector subsets.
Overall, more dominant TCR expansions were present within effector as opposed
to central/effector memory or naive cells, e.g. median TCR Vβ expansion rate
was highest on CD45RA+/CCR7- effector CD4+ and CD8+ cells (8 and 11 fold,
respectively) but absent on naive CD4+ and CD8+ cells. Remarkably, TCR
expansions were missing (0) or very low (0.5) on CD4+ and CD8+ central memory
population, respectively. The impact of CMV serostatus was also investigated:
6 vs. 1.5 fold expansion rate were encountered in CD8+ cells of CMV-positiv
versus CMV-negativ donors. In 18 virus specific T-cell cultures flowcytometry
data and sequences were correlated. An average of 4.3 Vβ expansions was
identified per cell line in CD4+ cells versus only 2.4 Vβ expansions in CD8+
subset; cross Wilcoxon testing showed highly significant difference (p =
0.002). The values of these expansion were post expansion higher (p < 0.002)
on CD8+ (37.7 %) than on CD4+ cells (9.2 %). Values between CD4+ and CD8+
prior to expansion showed no difference. Comparison of sequenced clonotypes
and baseline values gives new insights into the properties of the different
adoptive T-cell cultures. Effector T-cells show a strongly biased TCR
repertoire whereas surprisingly, central memory T-cells show a rather naive-
like distribution although they contain enhanced frequencies of antigen-
specific T-cells. These data suggest that antigen-driven expansion among long-
lived central memory is more polyclonal and in short-lived terminally
differentiated effector more oligoclonal. Furthermore, this study shows that
TCR flowcytometry in combination with TCR sequencing is a suitable tool to
identify clonal expansions in adoptive T-cells. Future studies are underway to
explore the in vitro and in vivo killing efficiency of expanded T-cells and to
correlate them with clonotypic sequence analysis.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
TCR repertoire
dc.subject
adoptive T-cell therapy
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Analyse des T-Zell-Rezeptor-Vβ-Repertoires und verschiedener T-Zell-
Subpopulationen mittels multiparametrischer Durchflusszytometrie und deren
Beeinflussung durch Virusinfektionen
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. med. H.-D. Volk
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. med. F. Kern
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. med. K. Asadullah
dc.date.accepted
2012-11-30
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000039899-6
dc.title.translated
Delineation of T-cell receptor Vβ repertoires in T-cell subsets with
flowcytometry and the influence of viral infections
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000039899
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000012400
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access