Based on the structural homology of the endogenous prototoxin lynx1 with the snake α-bungarotoxin, our lab has recently developed the tethered toxin (t-toxin) strategy for recombinant expression of functionally active, membrane-bound toxins, by using the biological scaffold of lynx1 (secretory signal and GPI signal). The work presented here expands the t-toxin approach and establishes for the first time the utility of t-toxins to specifically inhibit calcium currents in-vivo in mice. This has been accomplished by the integration of new modules and peptide toxins to generate novel t-toxins, and by using lentiviral vectors for gene delivery to targeted cells. The optimized constructs were generated by incorporation of several well-characterized peptide toxins, to achieve cell-specific and autonomous blockade of voltage gated calcium channels (Cav2.1 and Cav2.2; toxins: AgaIIIA, AgaIVA, MVIIA and MVIIC), as well as of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs; toxin: GID). In addition, fluorescent reporter proteins (EGFP, Venus and mCherry) were integrated to enable constant monitoring of the expression and subcellular localization. Furthermore, to achieve efficient insertion of t-toxins into the plasma membrane, the PDGF-receptor transmembrane domain or a glycophosphatidylinositol (GPI) anchor were attached. We show here that expression of calcium channel specific t-toxins by constitutive, inducible, as well as Cre-recombinase dependent lentiviral constructs can be efficiently used to inhibit Cav2.1 and Cav2.2 ionic currents in vitro in rat hippocampal neurons. Moreover, complete silencing of neurotransmission was achieved by simultaneous blockade of Cav2.1 and Cav2.2 by t-toxin co-transduction in these neurons. And importantly, the in vivo efficacy of this approach to block neurotransmission could be demonstrated by inhibition of dopaminergic signaling in the nigro-striatal pathway in lentivirus injected mice. In addition to calcium-channel t-toxins, the functionality of nAChR specific constructs was demonstrated in this work by inhibition of α7 and α3β4 nAChRs in Xenopus laevis oocytes. In conclusion, the optimized t-toxins generated in this work provide a straightforward new method to inhibit Cav2.1 and Cav2.2 voltage-gated calcium channels and nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) on long-term scale by recombinant and cell-autonomous expression in targeted cells. Given the extreme diversity of natural peptide venoms, membrane- tethered toxins are promising new tools for long-term modulation of neurotransmission by inhibition of specific ionic currents, and for characterization of the contribution of very diverse channels and receptors to physiological functions in a wide variety of species.
Basierend auf der strukturellen Ähnlichkeit des endogenen Prototoxins lynx1 mit dem Schlangengift α-Bungarotoxin hat unsere Arbeitsgruppe die sogenannte „tethered-toxin“ (T-Toxin) Methode entwickelt, bei welcher die Grundsequenz von lynx1, bestehend aus einem Sekretionssignal und einem Glycophosphatidylinositol (GPI)-Membrananker genutzt wird, um funktionale Peptidtoxine als Fusionsproteine membranständig zu exprimieren. In der vorliegenden Arbeit wurde diese Methode weiterentwickelt und die Funktionalität von T-Toxinen zur Inhibierung von Kalzium-Kanälen konnte zum ersten Mal in-vivo im Mausmodell demonstriert werden. Dies wurde zum einen durch die Integration neuer Module und Peptidtoxine, als auch durch die Verwendung lentiviraler Vektoren zum Gentransport in die Zielzellen ermöglicht. Der Einbau von genau charakterisierten Neurotoxinen ermöglicht die zell-spezifische und zell-autonome Inhibierung von Kalzium-Kanälen (Cav2.1 und Cav2.2; Toxine: AgaIIIA, AgaIVA, MVIIA und MVIIC), als auch von nikotinischen Azetylcholinrezeptoren (nAChR; toxin: GID). Zusätzlich wurden erstmals Fluoreszenzmarker integriert (EGFP, Venus und mCherry), welche eine ständige Expressions- und Lokalisationsanalyse der Fusionsproteine erlauben. Um die Membranständigkeit der Kostrukte zu gewährleisten wurde die Transmembrandomäne des PDGF-Rezeptors oder ein GPI- Membrananker verwendet. Wir konnten zeigen, dass die Inhibierung der Kalzium-Kanäle Cav2.1 und Cav2.2 duch spezifische T-Toxine von konstitutiven, induzierbaren und Cre-rekombinase abhängigen lentiviralen Vektoren zu einer Beeinflussung der Neurotransmission in kultivierten Hippocampus Neuronen führt. Zudem wurde eine vollständige Blockierung der Neurotransmission durch die gleichzeitige Inhibierung beider Kanäle nach Ko-Transduktion der T-Toxine erzielt. Bedeutenderweise konnte die Funktionalität dieser Konstrukte auch in vivo, durch Blockierung der Dopaminausschüttung im nigro-striatalen Signalübertragungsweg in Lentivirus- injizierten Mäusen gezeigt werden. Desweiteren wurde die Funktionalität von nAChR-spezifischen T-Toxinen durch Inhibierung von α7 und α3β4 nACh-Rezeptoren in Xenopus laevis Oocyten nachgewiesen. Die aus dieser Arbeit hervorgegangenen T-Toxine stellen eine Erweiterung der vorhandenen rekombinanten und pharmakologischen Methoden zur Untersuchung der physiologischen Funktionen von Ionenkanälen und Rezeptoren dar. Sie erlauben deren zell-spezifische und zell- autonome Langzeit-Inhibierung und können damit für die genauere Charakterisierung dieser Ionenkanäle und Rezeptoren in verschiedensten Tiermodellen verwendet werden.
