Bei der Therapie kritischer Knochendefekte im Rahmen des Tissue Engineerings wird versucht, mit zellbasierten Verfahren neue Behandlungsmöglichkeiten zu schaffen. Der Einsatz von mesenchymalen Stammzellen (MSC) scheint aufgrund ihres Proliferationsund Differenzierungspotentials vielversprechend. Um die Zellen auf ihren Einsatz in vivo vorzubereiten, sollten diese prädifferenziert werden. Dazu bietet sich mechanische Stimulation an. Ziel dieser Arbeit war es, mit einem neuartigen Bioreaktor den Einfluss mechanischer Stimulation auf die osteogene Differenzierung von verschiedenen Osteoprogenitorzellen in einer 3D-Fibrinmatrix auf RNA-Ebene zu bestimmen. In Vorversuchen sollte zudem die Eignung der Fibrinmatrix für die Verwendung in den Bioreaktoren bestimmt werden. Bei der Untersuchung zur Zelldichte in den verwendeten Konstrukten konnte die Gesamtzellvitalität ab einer Zelldichte von 2800 Zellen/μl Matrix kaum noch gesteigert werden. Durch Messung der Sauerstoffsättigung wurde eine Hypoxie der Zellen in den Konstrukten mit bis zu 2800 Zellen/μl Matrix ausgeschlossen. Da die Konstrukte im Hauptversuch drei Tage lang im gleichen Medium verbleiben sollten, wurde in den folgenden Versuchen Konstrukte mit 1400 Zellen/μl Matrix verwendet. Die Messung der Gesamtzellvitalität nach dreitägiger mechanischer Stimulation zeigte daraufhin keine Unterschiede zwischen belasteten Konstrukten und den Kontrollen. In den Versuchen zur Wirkung mechanischer Stimulation wurden undifferenzierte und durch siebentägige Kultur mit osteogenem Medium prädifferenzierte MSC sowie aus Auswachskulturen stammende Osteoblasten miteinander verglichen. Die Gegenüberstellung von nativen und prädifferenzierten MSC ohne mechanische Stimulation zeigte überraschenderweise eine stärkere Expression osteogener Marker bei den nativen MSC. Dies könnte durch Dedifferenzierung der prädifferenzierten MSC bei der Mobilisierung zur Konstruktherstellung erklärt werden. Bei den Untersuchungen zur Differenzierung durch mechanische Stimulation konnte festgestellt werden, dass sowohl native als auch prädifferenzierte MSC in der Osteogenese involvierte Gene, wie MMP-13 und SMAD-7, überexprimierten. Die deutlichsten Unterschiede traten beim Vergleich der verschiedenen Zellarten nach mechanischer Stimulation auf. Sowohl Gene, die im BMP/TGF-ß-Signalweg eine Rolle spielen, als auch Integrin ß1 und weitere wurden in mechanisch stimulierten nativen MSC vermehrt exprimiert. Diese Ergebnisse deuten auf eine bessere Ansprechbarkeit von undifferenzierten MSC auf mechanische Stimulation hin. Damit sind diese vielversprechende Kandidaten für die autologe Behandlung von Knochendefekten unter Einsatz mechanischer Stimulation zur Prädifferenzierung.
To treat critical bone defects tissue engineers try to achieve new therapeutical options by using cell-based processes. The use of mesenchymal stem cells (MSC) seems to be promising due to their proliferation and differentiation potential. To prepare these cells for use in vivo, they should be predifferentiated. This might be achieved by mechanical stimulation. The aim of this study was to investigate the influence of mechanical stimulation on osteogenic differentiation of different osteoprogenitor cells in a 3D- fibrin-matrix on the RNA level. To generate mechanical stimuli a novel bioreactor was used. Preliminary experiments should estimate the suitability of the fibrin-matrix for its use in bioreactors. The preliminary tests showed an increase of total cell viability up to a density of 2800 cells/μL matrix which barely changed with higher cell densities. Hypoxia of the cells in constructs with up to 2800 cells/μL matrix was excluded by measurement of the oxygen saturation. During the main tests the constructs were to remain in the same solution for three days, hence constructs with 1400 cells/μL matrix were used for the following experiments. The measurement of total cell viability after three days of mechanical stimulation showed no differences between mechanical stress exposed and control constructs. In the experiments on the effect of mechanical stimulation, native MSC, predifferentiated MSC, which had been cultured in osteogenic solution for seven-days, and osteoblasts, which were derived from outgrowth-cultures, were compared. Surprisingly, the comparison of native and predifferentiated MSC without mechanical stimulation showed a higher expression of osteogenic markers among the native MSC. This could be explained by dedifferentiation of already predifferentiated MSC during the mobilization of cells to form constructs. The studies of differentiation by mechanical stimulation showed that both native and predifferentiated MSC overexpressed genes involved in osteogenesis, such as MMP-13 and SMAD-7. The most significant differences occurred in the comparison of the different types of cells after mechanical stimulation. Genes involved in the BMP/TGF-ß-signaling-pathway, as well as Integrin ß1 and others were higher expressed in mechanically stimulated native MSC. These results indicate a greater responsiveness of native MSC to mechanical stimulation. Therefore they are promising candidates for the autologous treatment of critical bone defects, using mechanical stimulation for predifferentiation.
