Die genauen Bereiche, Strukturen und molekularen Mechanismen der Wechselwirkung zwischen dem für die Zellverbindung wichtigen zona occludence Protein 1 (ZO-1) sowie dem tight junction Protein Occludin beziehungsweise dem adherens junction Protein a-Catenin sind unbekannt. In dieser Arbeit wurden Bindungsstudien (Oberflächenplasmonresonanz-spektroskopie, Peptidmapping) mit Erkenntnissen aus homologen Modellen basierend auf Kristallstrukturen zu einem molekularen Modell kombiniert, was erstmals zeigte, dass sowohl Occludin als auch a-Catenin mit derselben Bindungsstelle von ZO-1 interagieren. Unsere Ergebnisse bestätigen das Konzept, dass ZO-1 nacheinander mit a-Catenin an den adherens junction und Occludin an den tight junction assoziiert.
Es gibt starke räumliche Hinweise, dass die C-terminale Coiled-coil-Domäne von Occludin dimerisiert und als Vierhelixbündel mit dem identifizierten Strukturmotiv von ZO-1 interagiert. Die Dimerisierung von Occludin wurde durch biophysikalische Experimente (Größenausschlusschromatographie, Lichtstreuung) belegt, während sich mit der Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie eine Oligomerisation von ZO-1 ergab. Auch in den Interaktionsbereichen von a-Catenin und ZO-1 wurden Helices mit Coiled-coil-Eigenschaften vorhergesagt. Laut den bekannten Kristallstrukturen und Homologiemodellen besteht a-Catenin ebenfalls aus mehreren Vierhelixbündeln. In Experimenten mit Peptidmapping binden Occludin406-521 and a-Catenin509-906 in der Hingeregion (ZO-1591-632 bzw. 591-622) und der GUK-Domäne (ZO-1726-754 und 756-781) von ZO-1 an helikale Bereiche, die teilweise Coiled-coil-Eigenschaften aufweisen. Die Selektivität beider Protein-Protein-Interaktionen ergibt sich aus komplementären Oberflächenformen und Ladungen zwischen den beteiligten Epitopen. Dabei bilden sich intermolekularer Helixbündel zwischen ZO-1 (Hingeregion/GUK-Domäne) sowie a-Catenin bzw. Occludin. Damit wurde ein gemeinsamer molekularer Mechanismus für die Assoziation von ZO-1 an adherens und tight junction identifiziert.
The exact sites, structures and molecular mechanisms of interaction between junction organizing zona occludence protein 1 (ZO-1) and the tight junction protein occludin or the adherens junction protein a-catenin are unknown. Binding studies by surface plasmon resonance spectroscopy and peptide mapping combined with comparative homology modeling utilizing crystal structures led for the first time to a molecular model revealing the binding of both occludin and a-catenin to the same binding site in ZO-1. Our data support a concept that ZO-1 successively associates with a-catenin at the adherens junction and occludin at the tight junction.
Strong spatial evidence indicates that the occludin C-terminal coiled-coil domain dimerizes and interacts as a four-helix bundle with the identified structural motifs in ZO-1. The dimerisation of occludin was supported by biophysical experiments (size exclusion chromatography, light scattering), while surface plasmon resonance spectroscopy found an oligomerisation of ZO-1. In the interacting regions of a-catenin and ZO-1 CC-helices were also predicted. a-Catenin likewise consists of several four-helix bundles according to crystal structures and homology models. In peptidemapping experiments occludin406-521 and a-catenin509-906 interacts with the hinge region (ZO-1591-632, 591-622 respectively) and with (ZO-1726-754, 756-781) in the GUK domain of ZO-1 containing coiled-coil and a-helical structures respectively. The selectivity of both protein-protein interactions is defined by complementary shapes and charges between the participating epitopes. In conclusion, a common molecular mechanism of forming an intermolecular helical bundle between the hinge region/GUK domain of ZO-1 and a-catenin and occludin is identified as a general molecular principle organizing the association of ZO-1 at adherens and tight junctions.
