dc.contributor.author
Zietze, Stefan
dc.date.accessioned
2018-06-07T15:06:01Z
dc.date.available
2006-07-19T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/573
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-4775
dc.description
TITLE, ACKNOWLEDGEMENTS, TABLE OF CONTENTS 3
CHAPTER ONE: INTRODUCTION 19 CHAPTER TWO: LITERATURE REVIEW 23 CHAPTER
THREE: MATERIAL AND METHODS (CLONE CREATION, UPSTREAM AND DOWNSTREAM PROCESS)
53 CHAPTER FOUR: GLYCOSYLATION ANALYSIS - METHOD EVALUATION 63 CHAPTER FIVE:
VALIDATION OF THE GLYCOANALYTICAL METHODS 124 CHAPTER SIX: APPLICATIONS 176
CHAPTER SEVEN: SUMMARY AND PERSPECTIVES 203 REFERENCES 214 CURRICULUM VITAE
222 LIST OF PUBLICATIONS 223 APPENDIX 225
dc.description.abstract
The presence and structure of oligosaccharides in glycoproteins are known to
influence the major characteristics of therapeutic proteins. The ability to
characterize the oligosaccharides during mammalian bioprocessing offers the
possibility to control and ensure the quality and consistency of those
proteins. This thesis presents a scheme using high-sensitive analytical
techniques for the quantitative measurement of microheterogeneic N-glycan-
structures of glycoproteins. The monitoring techniques include PNGaseF-
digestion, 2-aminobenzamide-labelling (2-AB), Anion Exchange Chromatography,
Hydrophilic Interaction Chromatography and Matrix Assisted Laser.Desorption
/Ionisation-Time of Flight-Mass Spectrometry. By using PNGaseF-digestion,
N-glycans were selectively separated from the rest of the protein. 2-AB-
labelling led to an unification of the different response factors of the
N-glycans. The high resoluting HPLC-techniques for the charged and the
uncharged oligosaccharides could be used to even detect intra-batch-
inconsistencies during continuous production processes. All methods were
standardized in SOPs and characterized by a validation approach. Relative
quantification approaches as well as two strategies for absolute
quantification have been described. The first strategy included a further
analytical method for the absolute quantification of sialic acids using
colorimetry and the second used the external standard 2-AB-labelled N-acetyl-
glucosamine for absolute quantification. The established methods were used to
examine the influence of different bioprocessing parameters on the
glycosylation of two recombinant model proteins. Only minor differences have
been observed. To evaluate these differences critically and to find out if
they were eventually based on the variability of the analytical methods, a
validation of the methods was performed corresponding to the needs for an
early clinical phase drug development. The statistical evaluation of the
methods resulted in exact limits for their variability in a certain working
range. Differences in processes could now be divided into significant and non-
significant (incidental) changes. The results of clone comparisons, harvested
products at different cultivation times within continuous production processes
and production systems working with different cell densities showed slight,
but sometimes significant changes in the glycosylation pattern of the model
proteins. The glycosylation differences could be separated in three categories
by their intensity. The major influence on glycosylation was observed between
different clones. This phenomenon could be used for clone selection procedures
that could not be decided by evaluation of the classical parameters
productivity and activity alone. Glycosylation criteria such as sialylation
rate have been found to gather useful information. Cultivation time was
observed to have the second intensive significant influence on glycosylation.
It was shown that dominant complex structures decreased and precursor-
structures evolved during long-time cultivation. Therefore, it was possible to
create a new stop time criterium for continuous production processes by
defining a limit for the crucial structure High Mannose. Comparison of
production systems with different cell densities was also possible with the
established techniques, but the density of the cells showed the least
intensive effect on glycosylation. This led to the conclusion that a transfer
of production processes from low cell density systems to high cell density
systems (e.g. stirred tank -> hollow-fibre-bioreactor) should be possible
without disadvantageous effects on product quality.
de
dc.description.abstract
Es ist bekannt, dass die Anwesenheit und Struktur von Oligosacchariden in
Glycoproteinen wesentliche Eigenschaften von therapeutischen Proteinen
maßgeblich beeinflusst. Die analytische Charakterisierung dieser
Oligosaccharide während des Produktionsprozesses ist daher von großer
Bedeutung und ermöglicht die Herstellung von Proteinen gleichbleibender
Qualität und übereinstimmender Struktur. Diese Doktorarbeit beschreibt ein
hoch sensitives analytisches Verfahren, welches die quantitative Messung der
Microheterogenität von N-Glykanstrukturen in Glycoproteinen ermöglicht. Die
verwendeten Techniken umfassten PNGaseF-Verdau, 2-Aminobenzamidmarkierung
(2-AB), Anionenaustauschchromatographie, hydrophile
Interaktionschromatographie und Matrix-unterstützte Ionisations-/Desorptions-
Flugzeit-Massenspektrometrie. Mit Hilfe des PNGaseF-Verdaus wurden die
N-Glykane selektiv vom Rest des Proteins abgetrennt. Durch die Markierung mit
2-AB konnte eine Vereinheitlichung der unterschiedlichen Response-Faktoren der
N-Glykane erreicht werden. Mittels hochauflösender HPLC-Methoden für geladene
und ungeladene Oligosaccharide konnten während eines kontinuierlichen
Produktionsprozesses sogar Uneinheitlichkeiten innerhalb einer Charge
ermittelt werden. Alle Methoden wurden in Standardarbeitsanweisungen (SOPs)
standardisiert und über eine Validierung charakterisiert. Es wurde ein
Verfahren zur Relativquantifizierung sowie zwei Strategien für die
Absolutquantifizierung beschrieben. Die erste Strategie beinhaltete eine
zusätzliche kolorimetrische Methode zur Bestimmung des absoluten
Sialinsäuregehaltes einer Proteinprobe. Bei der zweiten Methode diente 2-AB-
markiertes N-Acetylglucosamin als externer Standard zur
Absolutquantifizierung. Mit den entwickelten Methoden wurde der Einfluss
verschiedener Prozessparameter auf die Glykosylierung von zwei rekombinanten
Modellproteinen untersucht. Es wurden nur geringe Effekte beobachtet. Um die
Unterschiede kritisch beurteilen zu können und herauszufinden, ob diese
eventuell auf der Variabilität der analytischen Methoden beruhen, wurden diese
validiert. Die Validierung entsprach den Anforderungen für eine frühe
klinische Phase in der Arzneistoffentwicklung. Die statistische Auswertung der
Methoden ergab exakte Streuungsbreiten innerhalb eines bestimmten
Arbeitsbereiches. Prozessunterschiede konnten nun in signifikante und nicht-
signifikante (zufällige) Änderungen unterteilt werden. Es wurden Produkte
verschiedener Klone, als auch Produkte, die nach unterschiedlichen Zeiten in
einem kontinuierlichen Prozess geerntet wurden, untersucht. Zusätzlich wurden
Produkte aus Systemen mit unterschiedlichen Zelldichten miteinander
verglichen. Dabei wurden zwar nur geringfügige, aber zum Teil signifikante
Änderungen der Glykosylierungsmuster der Modellproteine beobachtet. Die
Unterschiede in der Glykosylierung konnten aufgrund ihrer Intensität in drei
Kategorien unterteilt werden. Der größte Einfluss auf die Glykosylierung ergab
sich durch den Einsatz verschiedener Klone. Dieses Phänomen konnte für die
Auswahl eines Produktionsklones genutzt werden, da die klassischen Parameter
Produktivität und Aktivität zur Entscheidungsfindung nicht ausreichend waren.
Es wurde ein Glykosylierungskriterium definiert, in diesem Fall der Grad der
Sialylierung, welches die Auswahl des bestmöglichen Klones für einen
Produktionsprozess ermöglichten. Den zweitgrößten Einfluss auf die
Glykosylierung hatte die Zeitdauer der Kultivierung. Es wurde gezeigt, dass
sich dominante komplexe Strukturen während einer Langzeitkultivierung
verringerten, wohingegen Vorläuferstrukturen häufiger auftraten. Daher war es
möglich ein neues Kriterium für das Beenden eines kontinuierlichen
Produktionsprozesses festzulegen, indem ein Grenzwert für die kritische
N-Glykanstruktur "High Mannose" festgelegt wurde. Mit den entwickelten
Verfahren war es auch möglich, Produktionssysteme mit unterschiedlichen
Zelldichten zu vergleichen. Allerdings zeigte die Zelldichte den geringsten
Einfluss auf die Glykosylierung. Daraus ergab sich die Schlussfolgerung, dass
der Wechsel eines Produktionsprozesses von niedrigen zu hohe Zelldichten hin
(z.B. von Rührkessel- zu Hohlfaserbioreaktorsystemen), ohne nachteiligen
Einfluss auf die Qualität des Produktes möglich ist.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Evaluation, validation and application of an analytical scheme for
N-glycosylation analysis used for mammalian cell production processes
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Rainer Helmut Müller
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Claus-Michael Lehr
dc.date.accepted
2006-07-05
dc.date.embargoEnd
2006-07-28
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000002186-3
dc.title.translated
Evaluierung, Validierung und Anwendung eines analytischen Schemas zur
N-Glykananalytik in Säugerzellproduktionsprozessen
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
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FUDISS_thesis_000000002186
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2006/375/
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open access