id,collection,dc.contributor.author,dc.contributor.firstReferee,dc.contributor.furtherReferee,dc.contributor.gender,dc.date.accepted,dc.date.accessioned,dc.date.available,dc.date.embargoEnd,dc.date.issued,dc.description,dc.description.abstract[de],dc.identifier.uri,dc.identifier.urn,dc.language,dc.rights.uri,dc.subject,dc.subject.ddc,dc.title,dc.title.translated[de],dc.type,dcterms.accessRights.dnb,dcterms.accessRights.openaire,dcterms.format[de],refubium.affiliation[de],refubium.mycore.derivateId,refubium.mycore.fudocsId,refubium.mycore.transfer "599f281b-17f0-4a21-8298-7080952bf14f","fub188/14","Zietze, Stefan","Prof. Dr. Rainer Helmut Müller","Prof. Dr. Claus-Michael Lehr","n","2006-07-05","2018-06-07T15:06:01Z","2006-07-19T00:00:00.649Z","2006-07-28","2006","TITLE, ACKNOWLEDGEMENTS, TABLE OF CONTENTS 3 CHAPTER ONE: INTRODUCTION 19 CHAPTER TWO: LITERATURE REVIEW 23 CHAPTER THREE: MATERIAL AND METHODS (CLONE CREATION, UPSTREAM AND DOWNSTREAM PROCESS) 53 CHAPTER FOUR: GLYCOSYLATION ANALYSIS - METHOD EVALUATION 63 CHAPTER FIVE: VALIDATION OF THE GLYCOANALYTICAL METHODS 124 CHAPTER SIX: APPLICATIONS 176 CHAPTER SEVEN: SUMMARY AND PERSPECTIVES 203 REFERENCES 214 CURRICULUM VITAE 222 LIST OF PUBLICATIONS 223 APPENDIX 225","The presence and structure of oligosaccharides in glycoproteins are known to influence the major characteristics of therapeutic proteins. The ability to characterize the oligosaccharides during mammalian bioprocessing offers the possibility to control and ensure the quality and consistency of those proteins. This thesis presents a scheme using high-sensitive analytical techniques for the quantitative measurement of microheterogeneic N-glycan- structures of glycoproteins. The monitoring techniques include PNGaseF- digestion, 2-aminobenzamide-labelling (2-AB), Anion Exchange Chromatography, Hydrophilic Interaction Chromatography and Matrix Assisted Laser.Desorption /Ionisation-Time of Flight-Mass Spectrometry. By using PNGaseF-digestion, N-glycans were selectively separated from the rest of the protein. 2-AB- labelling led to an unification of the different response factors of the N-glycans. The high resoluting HPLC-techniques for the charged and the uncharged oligosaccharides could be used to even detect intra-batch- inconsistencies during continuous production processes. All methods were standardized in SOPs and characterized by a validation approach. Relative quantification approaches as well as two strategies for absolute quantification have been described. The first strategy included a further analytical method for the absolute quantification of sialic acids using colorimetry and the second used the external standard 2-AB-labelled N-acetyl- glucosamine for absolute quantification. The established methods were used to examine the influence of different bioprocessing parameters on the glycosylation of two recombinant model proteins. Only minor differences have been observed. To evaluate these differences critically and to find out if they were eventually based on the variability of the analytical methods, a validation of the methods was performed corresponding to the needs for an early clinical phase drug development. The statistical evaluation of the methods resulted in exact limits for their variability in a certain working range. Differences in processes could now be divided into significant and non- significant (incidental) changes. The results of clone comparisons, harvested products at different cultivation times within continuous production processes and production systems working with different cell densities showed slight, but sometimes significant changes in the glycosylation pattern of the model proteins. The glycosylation differences could be separated in three categories by their intensity. The major influence on glycosylation was observed between different clones. This phenomenon could be used for clone selection procedures that could not be decided by evaluation of the classical parameters productivity and activity alone. Glycosylation criteria such as sialylation rate have been found to gather useful information. Cultivation time was observed to have the second intensive significant influence on glycosylation. It was shown that dominant complex structures decreased and precursor- structures evolved during long-time cultivation. Therefore, it was possible to create a new stop time criterium for continuous production processes by defining a limit for the crucial structure High Mannose. Comparison of production systems with different cell densities was also possible with the established techniques, but the density of the cells showed the least intensive effect on glycosylation. This led to the conclusion that a transfer of production processes from low cell density systems to high cell density systems (e.g. stirred tank -> hollow-fibre-bioreactor) should be possible without disadvantageous effects on product quality.||Es ist bekannt, dass die Anwesenheit und Struktur von Oligosacchariden in Glycoproteinen wesentliche Eigenschaften von therapeutischen Proteinen maßgeblich beeinflusst. Die analytische Charakterisierung dieser Oligosaccharide während des Produktionsprozesses ist daher von großer Bedeutung und ermöglicht die Herstellung von Proteinen gleichbleibender Qualität und übereinstimmender Struktur. Diese Doktorarbeit beschreibt ein hoch sensitives analytisches Verfahren, welches die quantitative Messung der Microheterogenität von N-Glykanstrukturen in Glycoproteinen ermöglicht. Die verwendeten Techniken umfassten PNGaseF-Verdau, 2-Aminobenzamidmarkierung (2-AB), Anionenaustauschchromatographie, hydrophile Interaktionschromatographie und Matrix-unterstützte Ionisations-/Desorptions- Flugzeit-Massenspektrometrie. Mit Hilfe des PNGaseF-Verdaus wurden die N-Glykane selektiv vom Rest des Proteins abgetrennt. Durch die Markierung mit 2-AB konnte eine Vereinheitlichung der unterschiedlichen Response-Faktoren der N-Glykane erreicht werden. Mittels hochauflösender HPLC-Methoden für geladene und ungeladene Oligosaccharide konnten während eines kontinuierlichen Produktionsprozesses sogar Uneinheitlichkeiten innerhalb einer Charge ermittelt werden. Alle Methoden wurden in Standardarbeitsanweisungen (SOPs) standardisiert und über eine Validierung charakterisiert. Es wurde ein Verfahren zur Relativquantifizierung sowie zwei Strategien für die Absolutquantifizierung beschrieben. Die erste Strategie beinhaltete eine zusätzliche kolorimetrische Methode zur Bestimmung des absoluten Sialinsäuregehaltes einer Proteinprobe. Bei der zweiten Methode diente 2-AB- markiertes N-Acetylglucosamin als externer Standard zur Absolutquantifizierung. Mit den entwickelten Methoden wurde der Einfluss verschiedener Prozessparameter auf die Glykosylierung von zwei rekombinanten Modellproteinen untersucht. Es wurden nur geringe Effekte beobachtet. Um die Unterschiede kritisch beurteilen zu können und herauszufinden, ob diese eventuell auf der Variabilität der analytischen Methoden beruhen, wurden diese validiert. Die Validierung entsprach den Anforderungen für eine frühe klinische Phase in der Arzneistoffentwicklung. Die statistische Auswertung der Methoden ergab exakte Streuungsbreiten innerhalb eines bestimmten Arbeitsbereiches. Prozessunterschiede konnten nun in signifikante und nicht- signifikante (zufällige) Änderungen unterteilt werden. Es wurden Produkte verschiedener Klone, als auch Produkte, die nach unterschiedlichen Zeiten in einem kontinuierlichen Prozess geerntet wurden, untersucht. Zusätzlich wurden Produkte aus Systemen mit unterschiedlichen Zelldichten miteinander verglichen. Dabei wurden zwar nur geringfügige, aber zum Teil signifikante Änderungen der Glykosylierungsmuster der Modellproteine beobachtet. Die Unterschiede in der Glykosylierung konnten aufgrund ihrer Intensität in drei Kategorien unterteilt werden. Der größte Einfluss auf die Glykosylierung ergab sich durch den Einsatz verschiedener Klone. Dieses Phänomen konnte für die Auswahl eines Produktionsklones genutzt werden, da die klassischen Parameter Produktivität und Aktivität zur Entscheidungsfindung nicht ausreichend waren. Es wurde ein Glykosylierungskriterium definiert, in diesem Fall der Grad der Sialylierung, welches die Auswahl des bestmöglichen Klones für einen Produktionsprozess ermöglichten. Den zweitgrößten Einfluss auf die Glykosylierung hatte die Zeitdauer der Kultivierung. Es wurde gezeigt, dass sich dominante komplexe Strukturen während einer Langzeitkultivierung verringerten, wohingegen Vorläuferstrukturen häufiger auftraten. Daher war es möglich ein neues Kriterium für das Beenden eines kontinuierlichen Produktionsprozesses festzulegen, indem ein Grenzwert für die kritische N-Glykanstruktur ""High Mannose"" festgelegt wurde. Mit den entwickelten Verfahren war es auch möglich, Produktionssysteme mit unterschiedlichen Zelldichten zu vergleichen. Allerdings zeigte die Zelldichte den geringsten Einfluss auf die Glykosylierung. Daraus ergab sich die Schlussfolgerung, dass der Wechsel eines Produktionsprozesses von niedrigen zu hohe Zelldichten hin (z.B. von Rührkessel- zu Hohlfaserbioreaktorsystemen), ohne nachteiligen Einfluss auf die Qualität des Produktes möglich ist.","https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/573||http://dx.doi.org/10.17169/refubium-4775","urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000002186-3","eng","http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen","glycosylation||biotechnology||glycoproteins||validation||analysis","500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie","Evaluation, validation and application of an analytical scheme for N-glycosylation analysis used for mammalian cell production processes","Evaluierung, Validierung und Anwendung eines analytischen Schemas zur N-Glykananalytik in Säugerzellproduktionsprozessen","Dissertation","free","open access","Text","Biologie, Chemie, Pharmazie","FUDISS_derivate_000000002186","FUDISS_thesis_000000002186","http://www.diss.fu-berlin.de/2006/375/"