Introduction: CTC (Circulating tumor cell) can provide molecular characterization of metastatic tumor cells and dynamically monitor therapy strategy, but CTC may lose epithelial biomarker expression during metastasis. The aim of our research is to increase the CTC detection rate by optimizing CTC staining and recovery and specifically evaluate GCC (guanylyl cyclase C) as a marker for circulating colorectal cancer cells. Methods: GCC protein was detected and compared in paired rectal cancer tissues and normal mucosal tissues from 80 cases by immunohistochemistry (data from China). Circulating GCCmRNA was detected from 160 stage I-III colorectal cancer patients by qRT- PCR, and analyzed with long -term survival (data from China). Several negative CTC enrichment-based protocols were used and optimized to increase the recovery rate of colorectal cancer cells. Several GCC antibodies were evaluated for staining of colorectal cancer cell lines and leukocytes by flow cytometry. Results: GCC protein was significantly over-expressed in rectal cancer tissues compared to paired normal mucosal tissues. High GCCmRNA level in peripheral blood was significantly associated with tumor emboli in vessels, lymph node metastases, mesenteric root lymph node metastases and poor survival. Together with tumor embolus in vessel and mesenteric root lymph node metastasis, GCCmRNA was a hazard factor for predicting poor patients’ survival by multivariate COX regression analysis. For optimizing CTC enrichment, the recovery of spiked CTC could be improved by an average of 16.23% by introducing a second round of depletion of the already negatively depleted CD45+ fraction. High GCC staining in T84, moderate in LS174T and low in other colon cancer cell lines were observed. Additionally, all the colon cancer cell lines showed a high percentage of cells expressing GCC (it ranged from 53.12% to 97.01%) at their first passage from frozen tube. Unfortunately, however, non-specific surface and intracellular binding of two conjugated GCC antibodies was observed (average rate 50.29% and 53.67%) when compared to isotype controls (average rate 10.74%), which restricts further application of GCC antibodies for CTC detection from patients. Conclusions: Additional depletion of CD45+ depleted fraction can increase the recovery rate of CTCs. Nonspecific binding of three GCC antibodies in leukocytes restricts their application in clinical practice. GCC antibodies without nonspecific binding site should be designed for CTC detection of colorectal cancer in the future.
Einleitung: Die Analyse CTC (zirkulierender Tumorzellen) wird entwickelt, um metastatische Tumoren molekular zu charakterisieren und Therapiestrategien dynamisch zu überwachen. Eine wesentliche Limitation ist aber die instabile Expression epithelialer Marker auf CTC. Das Ziel unserer Forschung ist es, die Wiederfindungsrate von CTC durch die Verwendung neuer gewebespezifischer Merker zu optimieren. Methoden: Das GCC-Protein (konjugierte Guanylylcyclase C) wurde als interessanter Marker definiert. Zunächst wurde die Expression von GCC beim Rektumkarzinom an gepaarten Proben von Tumorgewebe und normaler Schleimhaut an 80 Fällen durch Immunhistochemie verglichen (Daten aus China). Blutproben von 160 Patienten im Stadium I-III-Darmkrebs in China wurden durch qRT-PCR auf GCCmRNA untersucht und die Daten mit der Überlebenszeit verglichen. Mehrere Protokolle zur CTC-Anreicherung wurden entwickelt um die Wiederfindungsrate von Darmkrebszellen zu optimieren. GCC-Antikörper wurden hierfür mit Farbmarkern konjugiert bzw. konjugierte käuflich erworben und auf ihre Eignung zur Isolation von kolorektalen Tumorzellen in der Durchflusszytometrie getestet. Ergebnisse: GCC-Protein war in Rektumkarzinom im Vergleich zur normalen Schleimhaut stark überexprimiert. Hohe GCCmRNA- Spiegel im peripheren Blut waren signifikant mit Tumor-Embolien in Gefässen, Lymphknotenmetastasen, Lymphknotenmetastasen in der Mesenterialwurzel und schlechterem Überleben assoziiert. In der multivariaten Analyse waren Tumor Emboli, und Lymphknotenmetastasen in der Mesenterialwurzel und GCCmRNA unabhängige Risikofaktoren für das Überleben, mit oder ohne TNM-Schichtung. Als Optimierungsschritt für die CTC-Anreicherung wurde zusätzlich durch Recycling der CD45-positiven, CTC-abgereicherten Fraktion nochmals durchschnittlich 16% der eingesetzten Tumorzellen wiedergewonnen. Die GCC- Färbung war in T84 Zellen hoch, moderat in LS174T und niedrig in anderen Darmkrebszellen. Allerdings zeigten alle Colon-Krebszelllinien einen hohen Prozentsatz an GCC (von 53,12% bis 97,01%) in ihrer ersten Kulturpassage, die bei weiterer Kultivierung abnahm. Problematisch war eine nicht-spezifische Färbung von Leukozyten bei Oberflächen- und intrazellulärer Färbung mit den beiden selbst konjugierten GCC-Antikörpern (mittlere Rate 50,29% und 53,67%) und auch mit dem nachträglich kommerziell erworbenen direkt konjugiertem Antikörper, was die Anwendung von GCC-Antikörpern für die CTC-Detektion bei Patienten beschränkt. Schlussfolgerungen: Nach der CD45-Depletion kann die Wiederfindungsrate von CTCs durch zusätzliches Recycling von CTC aus der CD45+ Fraktion erhöht werden. Aufgrund der unspezifischen Färbung von Leukozyten können die GCC-Antikörper für die CTC-Erkennung trotz der guten Färbeeigenschaften bei Darmkrebszelllinien nicht verwendet werden, spezifische konjugierte GCC-Antikörper ohne Kreuzreaktion mit Leukozyten wären notwendig.