Telomeres are located at the ends of chromosomes and have an essential role in the maintenance of genome stability in all eukaryotes. The length of the telomeric DNA, an evolutionary highly conserved repetitive sequence, plays a crucial role both in cellular senescence and in carcinogenesis. In addition, a number of human genetic disorders have been identified which are characterized by dysfunctional telomeres, a defective DNA damage response, limited cell proliferation capacity in vitro and a highly increased cancer risk. Thus, telomere biology is directly linked to basic biological phenomena such as aging, tumorigenesis, maintenance of DNA integrity and chromosomal instability. Here, telomere length was analysed in various chromosomal instability syndromes, particularly in Nijmegen Breakage Syndrome (NBS) and a NBS mouse model. Three different complementary methods to measure telomere length were applied: (1) Quantitative-PCR (Q-PCR), based on the simultaneous amplification of telomeric repeats and a single copy gene, (2) Quantitative fluorescence in situ hybridization of telomere repeats (Q-FISH) in which the fluorescence intensity of single telomeres is measured relative to a constant repetitive sequence in the centromeric region of chromosome 2, allowing calculation of the relative length of individual telomeres, and (3)Terminal Restriction Fragment length analysis by Southern blot (TRF analysis) to measure the absolute average length of telomeric DNA. The results show that comparison of total telomere length, estimated by Q-FISH and Q-PCR in the same probes, resulted in a highly positive correlation with a correlation coefficient of r > 0.9. Thus, the Q-FISH and Q-PCR data, which both represent relative telomere lengths, show a tight linear relationship. Telomeric restriction fragment (TRF) analysis measures the average absolute telomere length. Here, absolute telomere length was compared with the relative length estimated by Q-PCR in the same seven DNA probes. There was a positive correlation with a correlation coefficient of r= 0.64. Based on this comparison, it was then possible to roughly convert the relative telomere lengths after Q-PCR into absolute lengths. Telomere length , measured in blood DNA of individuals less than 10 years of age, are significantly shorter in NBS-, NBS-like, AT and FA patients compared to controls and NBS-heterozygotes. Telomeres become shorter with age in normal individuals although at different rates throughout an individuals lifetime. Despite originally shorter telomeres, the shortening rate from birth to 20 years is almost the same in NBS patients and controls. The mean relative telomere length of females was slightly longer than in males, both in NBS patients and controls. This difference was, however, not significant, when a homogenous age cohort was compared. Estimation of telomere length in 14 different tissues of a NBS- fetus, terminated at 34 weeks of gestation, showed that the spinal cord, brain and heart had the longest telomeres, skin the shortest. Telomere length in 4 different tissues of a humanized Nbs mouse showed that in general the two control mice with the human wild type allele had slightly longer telomeres in all four tissues than the three mice with the mutant allele. Also here, telomeres in brain were the longest in two controls and one Nbs mouse, while almost no difference was found in the two other Nbs mice. These findings fit well with the general observation that the disease phenotype in Nbs mice is less severe than in NBS patients. Telomere lengths in diploid NBS and control fibroblasts decreased as a function of subculturing. As expected, the telomere lengths of the controls were much longer than those of the NBS fibroblasts. However in NBS and control lymphoblastoid cell lines the telomere lengths remained almost constant during cultivation. The same was observed in SV40 transformed NBS fibroblasts, however, telomeres were significantly shorter than in the original diploid fibroblasts. The human telomerase reverse transcriptase (hTERT) was highly expressed in the SV40 transformed NBS cell lines but not in the original diploid lines. Great variability of hTERT gene expression was found in the lymphoblastoid cell lines, ranging from high expression to no detectable mRNAs. Estimation of total telomere length by Q-FISH in NBS and control cell lines confirmed the results obtained by Q-PCR. The cell line with the shortest telomeres showed in some metaphases telomere fusions. In addition, the estimation of telomere length of individual chromosomes by Q-FISH showed a significant difference in telomere length between individual chromosome arms, both in NBS and control cells. In most cases the shortest telomeres were found on the p arm of chromosome 19, and the q arms of chromosomes 19, 17 and 20. In the lymphoblastoid cell line with the shortest total telomere length, the telomere of the p arm of one chromosome 19 was brightly fluorescent in 70 % of the metaphases, while the other chromosomes 19 displayed only weak fluorescence. The difference in relative T/C value (Telomere fluorescence/Centromere fluorescence) was about 11: 1 for the two chromosomes 19. To the best of our knowledge such an enormous elongation of a single telomere has not been described before in human chromosomes and might depend on a hitherto unknown mechanism. hTERT was only weakly expressed in this line. Another completely unexpected observation was made after Q-FISH in a fibroblast cell line, derived from a 9 years old NBS patient with the founder mutation (c.657_661del5). After chromosome analysis, two cell lines, one with 46 the other with 45 chromosomes, could be identified. The latter was due to a complex, unbalanced translocation. Interestingly, this aberrant line increased during subcultivation, from 50 % at passage 3 to about 90% at passage 7. Based on comparative genomic hybridization (CGH) and whole chromosome painting the aberrant karyotype is: 45,XY, der(6)(6pter→6q12 :: 13q21.1→13q34 :: 20q11.2→20qter), -13, ISCN 2009. Estimation of the cell cycle length after BrdU labelling illustrated that the cell cycle of the aberrant cells was shorter than that of the normal cells. In addition, after X-irradiation with 0.5 and 1.0 Gy the aberrant line had more chromosomal aberrations than the diploid line. Thus, the high radiosensitivity of the original NBS line was further increased. Moreover, the total telomere length was significantly longer in aberrant than that in the normal cells. Clearly, this line had a selective advantage in tissue culture and might represent an early (first) step in malignant transformation. Moreover, one can speculate that this specific combination of gain and losses of genetic material may reflect a mechanism for balancing the dosage of the affected genes. Altogether, the present findings underline the role of the NBN gene in telomere maintenance and shed new light on the chromosome instability inherent in NBS which increases their risk for haematological malignancies and solid tumours.
Telomere stellen die natürlichen Chromosomenenden aller Eukaryoten dar. Ihnen kommt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der genomischen Integrität zu. Es handelt sich um ein evolutionär hoch-konservierte repetitive Sequenzen, deren Länge insgesamt eine wichtige Rolle bei der zellulären Seneszenz und der Karzinogenese spielt. Es gibt es eine Reihe genetisch bedingter Krankheiten, die die Funktion der Telomere beeinträchtigen, die DNA Reparatur und die Zellproliferation einschränken sowie mit einem stark erhöhten Krebsrisiko einhergehen. Es besteht daher eine unmittelbare Verbindung zwischen der Biologie der Telomere und so grundlegenden biologischen Phänomenen, wie Alterung und Tumorgenese, Aufrechterhaltung der DNA Integrität und der chromosomalen Stabilität. In dieser Arbeit wurde die Telomerlänge bei verschiedenen Syndromen mit Chromosomeninstabilität analysiert, insbesondere dem Nijmegen Breakage Syndrom (NBS) and einem NBS Mausmodell. Hierbei wurden drei sich ergänzende Methoden eingesetzt: (1) Quantitative-PCR (Q-PCR), sie basiert auf der gleichzeitigen Amplifikation telomerischer Repeats und eines Einzelkopie-Gens und gibt die durchschnittliche relative Länger aller Telomere an, (2) Quantitative Fluoreszenz in situ Hybridisierung telomerischer Repeats (Q-FISH), bei der die Fluoreszenzintensität einzelner Telomere in Bezug zu einer konstanten repetitiven Sequenz der centromerischen Region von Chromosom 2 gesetzt und dadurch die relative Länge individueller Telomere bestimmt wird und (3) die „Terminal Restriction Fragment length analysis by Southern blot“ (TRF Analyse), durch die die durchschnittliche absolute Länge der Telomere ermittelt wird. Die Ergebnisse zeigen, dass die mittels Q-FISH und Q-PCR bestimmten Telomerlängen identischer Proben miteinander hoch korreliert sind. Der Korrelationskoeffizient ist r > 0.9. Das heißt, die Befunde nach Q-FISH und Q-PCR, die beide relative Telomerlängen widergeben, zeigen einen deutlichen linearen Bezug zueinander. Eine Vergleich der TRF Analyse und der Q-PCR derselben sieben Proben ergab ebenfalls eine positive Korrelation mit r = 0.64. Darauf gestützt, war es möglich, aus den mittels Q-FISH und Q-PCR ermittelten relativen Telomerlängen die absoluten Längen näherungsweise zu berechnen. Die Telomerlängen, die aus DNA der Blutproben von Kindern (<10 Jahre) mit Chromosomeninstabilität (NBS, „NBS-like“, Ataxia telangiectasia und Fanconi Anämie) ermittelt wurden, sind signifikant kürzer als die gesunder Kontrollkinder und NBS-Heterozygoter. Die Kontrollpersonen zeigten eine altersabhängige Verkürzung der Telomere, allerdings in unterschiedlichem Ausmaß zu verschiedenen Lebenszeiten. Bei den NBS-Patienten erfolgt die Verkürzung in den ersten 20 Lebensjahren ähnlich wie bei den Kontrollpersonen, wobei die Telomerlängen insgesamt wesentlich kürzer sind. Die Telomere weiblicher Personen waren etwas länger als die männlicher, sowohl bei den Kontrollen als auch bei den NBS-Patienten. Dieser Unterschied war jedoch nicht mehr signifikant, wenn homogene Alterskohorten verglichen wurden. Die Bestimmung der Telomerlängen in 14 unterschiedlichen Geweben eines NBS-Feten, der in der 34. Schwangerschaftswoche abortiert wurde, zeigte, dass Rückenmark, Gehirn und Herz die längsten Telomere aufwiesen, Hautgewebe die kürzesten. Die Analyse der Telomerlängen in 4 unterschiedlichen Geweben der “humanized” Nbs- Mäuse ergab, dass die beiden Mäuse mit dem menschlichen wildtyp Gen etwas längere Telomere besaßen als die drei Mäuse mit dem mutanten Allel. Auch hier wies das Gehirn beider Kontrolltiere und einer Nbs-Maus die längsten Telomere auf, wobei bei den anderen Nbs-Mäusen praktisch kein Unterschied gefunden wurde. Diese Befunde bestätigen die allgemeine Beobachtung, dass der Krankheitsphänotyp bei Nbs-Mäusen deutlich geringer ausgeprägt ist als bei NBS-Patienten. Die Telomerlänge in diploiden NBS- und Kontroll-Fibroblasten verkürzte sich in Abhängigkeit von der Zahl der Passagen. Auch hier waren erwartungsgemäß die Telomere der Kontrollzellen wesentlich länger als die der NBS-Zellen. In lymphoblastoiden NBS- und Kontroll-Zellen hingegen blieb die Telomerlänge während der Kultivierung praktisch konstant. Das Gleiche traf auch auf die SV40 transformierten NBS-Fibroblasten zu. In letzteren war jedoch die Länge der Telomere deutlich kürzer als in den ursprünglichen diploiden Fibroblasten. Die „human telomerase reverse transcriptase” (hTERT) war in den SV40 transformierten NBS-Zellen stark exprimiert, nicht jedoch in den Ursprungszellen. Eine erhebliche Variabilität der hTERT Expression wiesen die lymphoblastoiden Zellen auf, sie reichte von hoher bis nicht nachweisbarer Expression auf RNA-Ebene. Die Bestimmung der gesamten Telomerlänge nach Q-FISH in den NBS- und Kontroll-Zellen bestätigte die Q-PCR Befunde. Die NBS- Zelllinie mit den kürzesten Telomeren wies in einigen Fällen Telomerfusionen auf. Darüber hinaus zeigten die Telomere einzelner Chromosomen signifikante Längenunterschiede, sowohl bei den NBS- als auch den Kontroll-Zellen. In der Mehrzahl der Fälle wiesen der p arm von Chromosom 19 und der q Arm der Chromosomen 19, 17 und 20 die kürzesten Telomere auf. In der lymphoblastoiden NBS-Zelllinie mit den kürzesten Telomeren zeigte das Telomer des p Arms eines Chromosoms 19 in 70% der Metaphasen eine intensive Fluoreszenz, während die anderen Chromosomen 19 nur schwach fluoreszierende Telomere aufwiesen. Der Unterschied in der Fluoreszenzintensität betrug etwa 11 : 1. Nach unserer Kenntnis wurde eine derartige Verlängerung eines einzelnen Telomers bislang noch nicht für menschliche Zellen beschrieben und könnte auf einen neuen Mechanismus hinweisen. Die hTERT Expression war in dieser Zelllinie nur sehr gering. Ein vollkommen unerwarteter Befund ergab die Q-FISH Analyse primärer Fibroblasten, die von einem 9 Jahre alten NBS Kind mit der Gründermutation (c.657_661del5) stammten. Die Chromosomenanalyse ergab ein Mosaik aus einer Line mit 46 und einer mit 45 Chromosomen. Letztere wies eine komplexe, unbalanzierte Translokation auf. Diese Zellen nahmen von 50 % bei Passage 3 auf etwa 90% bei Passage 7 zu. Mittels „comparative genomic hybridization” (CGH) und „whole chromosome painting“ ergab sich für die aberrante Linie der Karyotyp: 45,XY, der(6)(6pter→6q12 :: 13q21.1→13q34 :: 20q11.2→20qter), -13, ISCN 2009. Die Bestimmung der Zellzykluslänge nach BrdU Markierung ergab für die aberrante Linie einen kürzeren Zellzyklus als für die normal diploide. Zusätzlich zeigte sich nach Bestrahlung mit 0.5 und 1.0 Gy, dass die aberrante Linie mehr Chromosomenschäden als die diploide aufwies, das heißt, die hohe Strahlenempfindlichkeit der ursprünglichen NBS-Zelllinie wurde noch weiter verstärkt. Zudem war auch die Länge der Telomere gegenüber den diploiden Zellen signifikant erhöht. Zweifellos hat die aberrante Zellinie einen Selektionsvorteil in der Gewebekultur und könnte einen frühen (ersten) Schritt zu maligner Transformation repräsentieren. Darüber hinaus kann man vermuten, dass die spezifische Kombination von zusätzlichem und fehlendem Erbgut einen „Mechanismus“ darstellt, um die Dosis-Unterschiede der betroffenen Gene auszugleichen. Insgesamt unterstreichen die Befunde die Bedeutung des NBN-Gens für die Stabilisierung der Telomere und werfen ein neues Licht auf die Chromosomeninstabilität bei NBS-Patienten mit ihrem hohen Risiko für hämtologische und solide Tumore.
