The aim of this work was to find answers for the following questions: what is the primary electron donor in PS2 and what is the bottleneck for the decay of excited states? These two questions triggered additional questions: • What are the values of the site energies of the pigments in PS2? • On which pigment(s) does the triplet state stabilize in the RC? • On which pigment(s) of the RC does the hole stabilize after charge separation? • What is the identity of the excitation energy trap states in the antenna complexes CP43 and CP47? • Why is energy relaxation after light excitation in the CP43 complex about five times faster than in the CP47 complex at low temperatures? • Is it possible to describe the spectroscopic properties of PS2 from di®erent species with the same set of parameters? A genetic algorithm was used to obtain the site energies of the RC pigments in D1-D2- cytb559 complexes. These parameters were further used for a description of several independent experiments performed on the same complex. The site energies obtained, are almost symmetric in the two branches, except for the one of ChlD1, the latter being lower by about 30 meV than the one of its D2-counterpart ChlD2. The lowest exciton state of the RC is dominated by the excited state of ChlD1, which has the lowest site energy of all reaction center pigments. The same procedure was applied to the antenna complexes CP43 and CP47. The lowest exciton state in PS2 core complexes is dominated by Chl29 of the CP47 complex. In the CP43 complex two low-energy exciton states were found, allowing the identification of the low-energy trap states. From the calculations of T-S spectra of the D1-D2-cytb559 complex at diferent temperatures strong evidence was obtained for the stabilization of the triplet state at ChlD1 at low temperatures and a thermal distribution of the triplet energy between PD1 and ChlD1 at higher temperatures. An energy difference of 10 meV was obtained for the two triplet states, 3PD1 and 3ChlD1. Based on the assignment of the site energies for D1-D2-cytb559 complexes, several independent experiments performed on PS2 core complexes were described. Calculation of the difference absorption spectra of PS2 core complexes clearly show that after primary charge separation the hole stabilizes at PD1. From the calculations of T-S difference spectra at different temperatures strong evidence is given for the stabilization of the triplet state at ChlD1 at low temperatures and a thermal distribution between PD1 and ChlD1 at higher temperatures. An energy difference of 11 meV was obtained between the two triplet states, 3PD1 and 3ChlD1 in PS2 core complexes which is practically identical to the energy difference in D1-D2-cytb559 complexes. Using a simple model for primary electron transfer a measured temperature dependence of the fast phase can only be explained if ChlD1 is assumed to be the primary electron donor in PS2. The site energy of ChlD1 is even more red shifted in PS2 core complexes than in D1-D2-cytb559 complexes. Additionally to the temperature dependence of the site energy of ChlD1, also the site energy of PD1 shows such a dependence. The lowest excited state is strongly localized on ChlD1 and consequently primary electron transfer at low temperatures starts from this pigment, as discussed above for D1-D2-cytb559 complexes. At physiological temperatures the energy gap between the lowest excited state dominated by ChlD1 and the ”special pair” is reduced from 10 nm at 5K to 6 nm. At room temperature, after exciton equilibration different local excited states are populated. Nevertheless still the dominant contribution comes from ChlD1, which is twice as large as that of PD1, making it likely that also at room temperature the primary charge separation is initiated from ChlD1. A set of site energies was provided that describes the stationary and time- resolved spectra of the CP43 and CP47 subunits of PS2. In particular, the low-energy trap states in these subunits were identified, which are important for light-harvesting and photo-protection, because they determine the direction of excitation energy flow and the sites where Chl triplet states form under light stress. On this basis, the decay of excited states in PS2 core complexes was modeled. The main 40-50 ps decay component of excited states measured at room temperature can only be described by assuming that the primary electron transfer is ultrafast ((300fs)−1 corresponding to an intrinsic rate constant of (100fs)−1) and that the free energy difference between the equilibrated exciton states in the RC and the second radical pair state is about 175 meV or larger, so that charge recombination reactions are slow. The calculations demonstrate clearly that the bottleneck for the decay of excited states in PS-II core complexes with open RCs is due to the transfer from the CP43 and CP47 subunits to the RC, i.e. the decay is transferto-the- trap limited. Evidence is presented that the parameters used for the description of the spectra of T. elongatus describe as well the spectroscopic properties of di®erent species. Small variations of the site energy of ChlD1 were observed in such cases. The present model suggests a mode switch from a light harvesting mode for open RCs to a photoprotective mode for closed RCs. For the latter, the rate constant for primary electron transfer slows down to an extent that it becomes comparable to the rate for excitation energy transfer from the RC to the core antennae. In this case a considerable part of the excitation energy of the reaction center will return to the antennae and the triplet energy of chlorophyll can be quenched by the carotenoids there. The overall design principle seems to be a RC that is higher in free energy than the antenna, giving rise to fast exit channels for the excitation energy, that are activated only when the RC is closed. This principle is a compromise between high energy transfer effciency and photochemical stability of the system. The following predictions of the present model can be tested by experiments: (i) The main decay component of the fluorescence changes from 40-50 ps at room temperature to 25 ps at 77 K, reflecting faster transfer from CP43 to the RC. In addition, a wide distribution of transfer times with a maximum at 200 ps appears at 77 K, reflecting slower and highly dispersive transfer from CP47 to the RC. (ii) The fluorescence decay for closed RCs at room temperature contains a 40 ps excitation energy transfer component that is due to transfer between CP43 and CP47 via the RC. Summarizing, the proposed model fully explains the spectroscopic properties of the PS2 corecomplexes and its subunits as it was shown by a description of a large number of independent experiments. Moreover the model has predictive power, which was demonstrated for the mutant studies of the Q−A−QA spectra. The predictive power can be further tested as proposed above. The site energies obtained for the RC pigments of T. elongatus can be used to explain spectroscopic properties of PS2 core complexes of different species, not only bacteria but also higher plants, as it was shown for Q−A−QA spectra of pea and spinach and mutant studies of Synechocystis. The present calculations clearly show that ChlD1 is the primary electron donor in PS2 and that the decay of the excited states is limited by the excitation energy transfer from the antenna complexes CP43 and CP47 to the RC.
Das Ziel dieser Arbeit war, Antworten auf die folgenden Fragen zu finden: Was ist der primäre Elektronen-Donator im Photosystem 2 (PS2) und was ist der Engpass für den Zerfall von Anregungszust änden? Diese beiden Fragen geben Anlass zu weiteren Fragen: • Welche Werte haben die lokalen ¨Ubergangsenergien der Pigmente im PS2? • Auf welchem Pigment (welchen Pigmenten) stabilisiert sich der Triplettzustand im Reaktionszentrum (RZ)? • Auf welchem Pigment (welchen Pigmenten) des Reaktionszentrums stabilisiert sich das Loch nach der Ladungstrennung? • Welche Identit¨at haben die Anregungsenergie-Senken in den Antennen-Komplexen CP43 und CP47? • Warum ist bei tiefer Temperatur die Energie-Relaxation nach Lichtanregung im CP43- Komplex etwa f¨unfmal schneller als im CP47-Komplex? • Ist es m¨oglich die spektralen Eigenschaften von PS2-Komplexen verschiedener Arten mit dem gleichen Parametersatz zu beschreiben? Ein genetischer Algorithmus wurde benutzt um die lokalen Übergangsenergien der RZPigmente in D1-D2-cytb559-Komplexen zu erhalten. Diese Parameter wurden im weiteren zur Beschreibung verschiedener unabh¨angiger Experimente an dem gleichen Komplex benutzt. Dieerhaltenen Übergangsenergien sind annähernd symmetrisch für die beiden Äste, mit Ausnahme der von ChlD1, welche rund 30 meV niedriger ist als die Übergangsenergie ihres Gegenübers im D2-Ast, ChlD2. Der niedrigste Anregungszustand des Reaktionszentrums wird bestimmt durch den angeregten Zustand von ChlD1, welcher die niedrigste Übergangsenergie von allen RZ-Pigmenten hat. Das gleiche Verfahren wurde auf die Antennenkomplexe CP43 und CP47 angewendet. Der niedrigste Anregungszustand im PS2-core-Komplex wird bestimmt durch das Chl-29 des CP47-Komplexes. Im CP43-Komplex wurden zwei niedrig-energetische Anregungszust ände gefunden, welche die Identifikation der Energie-Senke ermöglichen. Berechnungen von T−S-Spektren des D1-D2-cytb559-Komplexes für verschiedene Temperaturen wiesen überzeugend darauf hin, dass der Triplettzustand sich bei niedriger Temperatur auf ChlD1 stabilisiert, und sich bei h¨oherer Temperatur thermisch auf PD1 und ChlD1 verteilt. Für die beiden Triplettzustände 3PD1 und 3ChlD1 wurde eine Energiedifferenz von 10 meV berechnet. Auf der Zuordnung der Übergangsenergien für den D1-D2-cytb559-Komplex basierend, wurden verschiedene unabhängige Experimente am PS2-core-Komplex beschrieben. Die Berechnung des Absorptions- Differenzspektrums des PS2-core-Komplexes zeigt klar, dass sich das Loch nach der primären Ladungstrennung auf PD1 stabilisiert. Berechnungen von T−S-Differenzspektren für verschiedene Temperaturen weisen stark darauf hin, dass sich der Triplettzustand bei niedrigen Temperaturen auf ChlD1 stabilisiert, und bei höheren Temperaturen thermisch auf PD1 und ChlD1 verteilt. Für die beiden Triplettzustände 3PD1 und 3ChlD1 des PS2-core- Komplexes ergab sich eine Energiediffrenz von 11 meV, was praktisch identisch mit der Energiedifferenz im D1-D2-cytb559-Komplex ist. Unter Verwendung eines einfachen Modells für den primären Elektronentransfer kann die gemessene Temperaturabhängigkeit der schnellen Phase nur erklärt werden, wenn angenommen wird, dass ChlD1 der primäre Elektronen-Donator im PS2 ist. Die Übergangsenergie von ChlD1 ist im PS2-core-Komplex sogar stärker rot- verschoben als im D1-D2-cytb559-Komplex. Nicht nur die Übergangsenergie von ChlD1 ist temperaturabhängig, sondern auch die von PD1. Der niedrigste Anregungszustand ist stark lokalisiert auf ChlD1, daher beginnt der primäre Elektronentransfer bei tiefen Temperaturen an diesem Pigment, wie zuvor schon für den D1-D2-cytb559-Komplex diskutiert wurde. Bei physiologischen Temperaturen reduziert sich die Energiedifferenz zwischen dem niedrigsten Anregungszustand, bestimmt durch ChlD1, und dem ”special pair” von 10 nm (bei 5 K) auf 6 nm (bei 300 K). Bei Raumtemperatur sind nach Äquilibrierung der Anregungsenergie die lokalen Anregungszustände aller RZ-Pigmente besetzt. Dennoch kommt der dominante Beitrag immer noch von ChlD1, welcher doppelt so groß ist wie der von PD1, was es wahrscheinlich macht, dass auch bei Raumtemperatur die primäre Ladungstrennung von ChlD1 ausgeht. Ein Satz von Übergangsenergien wurde bestimmt, der die stationären and zeitaufgelösten Spektren der PS2-Untereinheiten CP43 und CP47 beschreibt. Insbesondere die Energie-Senken dieser Untereinheiten wurden identifiziert. Diese sind wichtig für Lichtsammlung und Lichtschutz, weil sie sowohl die Richtung des Anregungsenergieflusses bestimmen, als auch die Stellen, an denen sich Chl- Triplettzustände bilden, wenn Licht-Stress herrscht. Darauf basierend wurde der Zerfall der Anregungszustände im PS2-core-Komplex modelliert. Die Hauptzerfallskomponente (40-50 ps) der Anregungszustände, gemessen bei Raumtemperatur, kann nur unter der Annahme erklärt werden, dass der primäre Elektronentransfer ultraschnell ist (100 (fs)−1) und die freie-Energie- Differenz zwischen den äquilibrierten Anregungszuständen im RZ und dem zweiten Radikalpaar-Zustand ungefähr 175 meV oder größer ist, so dass die Ladungs- Rekombinationsreaktionen langsam ablaufen. Die Berechnungen zeigen klar, dass der Energietransfer von den Untereinheiten CP43 und CP47 zum RZ den Engpass für den Zerfall der Anregungszust ände im PS2-core-Komplex mit geöffnetem RZ darstellt. Es wurde gezeigt, dass die Parameter, die für die Beschreibung der Spektren von T. elongatus benutzt wurden, ebenfalls die Eigenschaften der Spektren verschiedener anderer Spezies beschreiben. In diesen F¨allen wurden kleine Variationen der Übergangsenergie von ChlD1 beobachtet. Das aktuelle Modell legt ein Umschalten vom Lichtsammel-Modus bei offenem RZ in einen Lichtschutz-Modus bei geschlossenem RZ nahe. F¨ur letzteren reduziert sich die Ratenkonstante für primären Elektronentransfer auf eine Größe, die vergleichbar ist mit der Rate des Anregungsenergietransfers vom RZ zu den core-Antennen. In diesem Fall wird ein beträchtlicher Anteil der Anregungsenergie des RZ zu den Antennen zurückkehren und die Triplett-Energie des Chlorophylls kann durch die Karotinoide in den Antennen gelöscht werden. Das Bauprinzip scheint ein RZ mit höherer freier Energie als die der Antennen vorzusehen, was zur Folge hat, dass es schnelle Ausgangskanäle für die Anregungsenergie gibt, welche nur aktiv sind, wenn das RZ geschlossen ist. Dieses Prinzip ist ein Kompromiss zwischen hoher E±zienz des Energietransfers und photochemischer Stabilität des Systems. Die folgenden Vorhersagen des gegenwärtigen Modells können durch Experimente überprüft werden: (i) Die Hauptzerfallskomponente der Fluoreszenz ändert sich von 40-50 ps bei Raumtemperatur auf 25 ps bei 77 K, was den schnelleren Transfer von CP43 zum RZ wiederspiegelt. Zusätzlich tritt bei 77 K eine breite Verteilung mit einem Maximum bei 200 ps auf, welche den langsameren und stark dispersiven Transfer von CP47 zum RZ wiedergibt. (ii) Der Fluoreszenz-Zerfall bei geschlossenem RZ und Raumtemperatur enth¨alt einen 40 ps Anregungenergietransfer-Beitrag, infolge des Transfers zwischen CP43 und CP47 über das RZ. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das vorgeschlagene Model die spektralen Eigenschaften des PS2-core-Komplexes und seiner Untereinheiten vollständig erklärt, wie durch die Beschreibung einer großen Anzahl von unabhängigen Experimenten gezeigt wurde. Darüberhinaus ist das Modell vorhersagef¨ahig, wie anhand der Mutanten- Studie der Q−A−QA-Spektren gezeigt wurde. Die Vorhersagekraft kann überprüft werden wie oben vorgeschlagen. Die Übergangsenergien, die für die RZ-Pigmente von T. elongatus erhalten wurden, können verwendet werden um die Eigenschaften der Spektren des PS2-core-Komplexes verschiedener Spezies zu erklären, und zwar nicht nur von Bakterien, sondern auch von höheren Pflanzen, wie anhand der Q−A−QA-Spektren von Erbsen und Spinat, sowie Mutanten-Studien an Synechocystis gezeigt wurde. Die vorliegenden Rechnungen zeigen deutlich, dass ChlD1 der primäre Elektronendonor im PS2-Komplex ist, und dass der Zerfall der Anregungszustände limitiert ist durch den Anregungsenergietransfer von den Antennenkomplexen CP43 und CP47 zum Reaktionszentrum.
