Vitamin B6 übt in Form von Pyridoxal 5‘-Phosphat (PLP) als Kofaktor eine entscheidende Funktion für viele essentielle enzymatische Reaktionen in diversen Stoffwechselwegen aus und ist damit unverzichtbar für alle Organismen. Pflanzen, Pilze, Archaeen und einige Bakterien besitzen die Fähigkeit, Vitamin B6 selbst herzustellen. Tierische Organismen, der Mensch eingeschlossen, können dagegen Vitamin B6 nicht neu synthetisieren und sind auf dessen Aufnahme durch die Nahrung angewiesen. In Pflanzen wird das Vitamin durch die Aktivität der Enzyme PDX1 und PDX2 gebildet. In der vorliegenden Arbeit wurde die pflanzliche Vitamin B6 Biosynthese in Arabidopsis thaliana und Ginkgo biloba untersucht und wichtige Informationen über die Funktion der PDX Proteine erlangt. A. thaliana kodiert für drei PDX1 Proteine, AtPDX1.1, AtPDX1.2 und AtPDX1.3, sowie ein PDX2 Protein. Anhand von AtPDX Überexpressionslinien konnte gezeigt werden, daß der Gehalt an Vitamin B6 im Blattgewebe durch die ektopische Expression eines einzelnen AtPDX1 Proteins, AtPDX1.1, signifikant erhöht werden kann. Dagegen führte die ektopische Expression von AtPDX1.3 zu lichtsensiblen Pflanzen mit einem verringerten Vitamin B6 Gehalt und stark veränderten Metabolitwerten. Analysen der AtPDX1 und AtPDX2 Proteine durch Größenausschlußchromatographie und Blue Native Page zeigten, daß die Proteine in hochmolekularen Komplexen in der Pflanzenzelle vorliegen. Die Untersuchungen mit dem BIFC System wiesen zudem nach, daß die AtPDX1 Proteine in homomeren und heteromeren Komplexen in planta vorliegen können. Die Daten geben damit erstmals Hinweise auf die Bildung einer pflanzlichen PLP Synthase. Überraschenderweise konnte das biosynthetisch inaktive AtPDX1.2 Protein ebenfalls in hochmolekularen Komplexen nachgewiesen werden, was eine Bedeutung des Proteins in PLP Synthasekomplexen denkbar macht. Die weiteren Untersuchungen an AtPDX1.2 weisen zudem auf eine Beteiligung des Proteins an Vorgängen in der Embryogenese sowie bei der zellulären Stressantwort hin. Darüber hinaus konnte At5g65840 als AtPDX1 Interaktor bestätigt werden und könnte somit neue Funktionen für AtPDX1 aufzeigen. At5g65840 ist als putative Alkyl-Hydroperoxid Reduktase und Thiol- spezifisches Antioxidant beschrieben und könnte daher zusammen mit AtPDX1 Proteinen eine wichtige Rolle unter Stressbedingungen spielen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde zum ersten Mal eine Analyse des Vitamin B6 biosynthetisch aktiven PDX1 Proteins von G. biloba durchgeführt. Die PDX1 Proteine von Ginkgo und Arabidopsis weisen einen hohen Konserviertheitsgrad auf, der durch eine phänotypische Komplementation der Vitamin B6 defizienten Arabidopsis rsr4-1 Mutante bestätigt werden konnte. Zudem zeigen die PDX1 Proteine der beiden Spezies eine hohe Übereinstimmung in ihren Bindungseigenschaften. Die subzelluläre Expression von GbPDX1 in G. biloba weist darüber hinaus auf eine Kopplung der Vitamin B6 Biosyntheseaktivität und dem 4’-O-methylpyridoxine-(Ginkgotoxin)-gehalt, was für das Verständnis der Ginkgotoxinbildung einen wichtigen Schritt darstellt. Insgesamt zeigen die in der vorgelegten Arbeit gesammelten Daten die Wichtigkeit der PDX Proteine für die Vitamin B6 Biosynthese und unterstreichen damit deren Bedeutung für den pflanzlichen Metabolismus.
Vitamin B6 is an important compound for all living organisms and serves as pyridoxal 5’-phosphate (PLP) as an enzymatic cofactor for a broad range of biochemical reactions. Plants, fungi, archaea and some bacteria are able to de novo synthesize vitamin B6, whereas animals, including humans, rely on the external supply of the vitamin B6. In plants, the vitamin B6 is synthesized by the action of PDX1 and PDX2 proteins. The present work provides new information about plant PDX proteins and their function in vitamin B6 biosynthesis of Arabidopsis thaliana and Ginkgo biloba. Arabidopsis encodes for three different PDX1 proteins, named AtPDX1.1, AtPDX1.2 and AtPDX1.3 but only for one AtPDX2 protein. Analysis of plants overexpressing the different AtPDX proteins show that ectopic expression of AtPDX1.1 protein is sufficient to significantly increase the vitamin B6 content in Arabidopsis leaves. Interestingly, ectopic expression of specifically AtPDX1.3 caused a light sensitive plant phenotype, as well as reduced vitamin B6 levels and widely changed metabolite profile. Size exclusion chromatography and blue native page analysis revealed that AtPDX1 and AtPDX2 proteins assemble in high molecular weight complexes. By using BIFC technology, in planta assembly of the different AtPDX1 proteins was demonstrated. This allows postulation of homomeric and heteromeric AtPDX1 complexes. The data provide first insights into plant vitamin B6 PLP synthase complex formation. Noteworthy, AtPDX1.2 is also present in the described high molecular order complexes, although it has no vitamin B6 biosynthetic activity in vitro. This suggests a role of AtPDX1.2 in the PLP synthase complex. Further studies on AtPDX1.2 connect the function of the protein with embryo development and cellular stress response. The work on the AtPDX1 binding protein At5g65840 suggests new functions for AtPDX1 proteins. At5g65840 is described as a putative alkyl-hydroperoxide reductase und thiol-specific antioxidant, and it is potentially possible that AtPDX1 and At5g65840 proteins are connected in their function in aboitic stress response. The second part of this thesis focuses on the functional characterization of a GbPDX1 protein. Ginkgo and Arabidopsis PDX1 proteins show a high degree of functional conservation which was demonstrated by yeast-two-hybrid assays and functional complementation of the Arabidopsis PDX1.3 mutant rsr4-1. Furthermore the high expression of GbPDX1 in G. biloba tissues with increased amounts of 4’-O-methylpyridoxine (ginkgotoxin) leads to the assumption, that the formation of ginkgotoxin depends on the rate of vitamin B6 biosynthesis. Overall the work presented in this thesis underscores the significance of PDX proteins for vitamin B6 biosynthesis and whole metabolism in plants.
