Untersuchungen zur Mikrosatellitenalteration an zellfreien Desoxyribonukleinsäuren aus der Bronchiallavage bei Patienten mit Lungenkarzinom und Patienten mit benignen Lungenerkrankungen

Abstract

Die frühzeitige Diagnosestellung ist der entscheidende, prognostische Faktor bei einem Lungenkrebsleiden. Folglich sind neue Erkenntnisse in der Lungenkarzinomdiagnostik von größter Relevanz. Die Bronchoskopie ist ein zentraler Bestandteil dieser Diagnostik. Die Gewinnung von Bronchiallavage als Teil der bronchoskopischen Untersuchung ist ein supplementäres Verfahren, welches insbesondere bei nicht einsehbaren, extrabronchialen oder peripheren Lungenbefunden von Bedeutung ist und bisher ausschließlich der Akquise von zytologischem Material dient. In der Vergangenheit konnte zellfreie DNA aus dem Serum und Plasma isoliert werden. Es gilt mittlerweile als bewiesen, dass diese zellfreie DNA bei Tumorpatienten zumindest anteilig auch aus dem Tumorgewebe stammt. Basierend auf diesen Kenntnissen sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob (i) und (ii) in welcher Quantität sich extrazelluläre DNA aus der BL isolieren lässt und (iii) ob sich tumorassoziierte, genetische Alterationen, nämlich die Mikrosatellitenalterationen (MA) in diesem neuen, diagnostischen Kompartiment detektieren lassen. In die Untersuchungen wurden insgesamt 59 Patienten eingeschlossen, darunter 30 Patienten mit einem histologisch gesicherten Lungenkarzinom (24 NSCLC, 6 SCLC) und 29 tumorfreie Patienten mit Indikation zur Bronchoskopie. Für die Isolation der extrazellulären DNA aus der BL wurden zwei Extraktionsmethoden etabliert, eine DNA-Extraktion mit heißem Phenol und Isopropanol und die DNA-Extraktion mit dem QiaAMP DNA Blood Mini KitⓇ. Die Extraktion extrazellulärer DNA gelang ausnahmslos in allen Patienten. Dabei zeigte sich die Extraktion mittels des QiaAMP DNA Blood Mini KitⓇ in Bezug auf Menge, Arbeits- und Zeitaufwand überlegen. Die extrazelluläre DNA wurde mit drei PCR-basierten Methoden erfolgreich analysiert (qualititative Extraktionskontrolle, quantitative real time-PCR und Mikrosatellitenanalyse), so dass von einer ausreichenden Qualität für molekularbiologische Untersuchungen ausgegangen werden kann. Für die Quantifikation der extrahierten DNA wurde eine quantitative real time-PCR nach Yuan et al. etabliert (64). Die DNA-Konzentrationen variierten in hohem Maße zwischen den einzelnen Patienten. Bezogen auf einen Milliliter BL lagen die DNA- Konzentrationen zwischen 0,1 ng/ml und 3,9 µg, entsprechend einer Streuung über fünf dekadische Potenzen. Signifikante Unterschiede zwischen den Tumor- und Kontrollpatienten bestanden nicht. Die Analyse zum Nachweis von Mikrosatellitenalterationen (MA) ergab insgesamt 19 MA in der zellfreien DNA aus der BL, darunter 13 MA in der Gruppe der Tumorpatienten und sechs MA in der Gruppe der tumorfreien Patienten. Dabei zeigten die Patienten mit einem SCLC signifikant mehr MA als die Patienten mit einem NSCLC. Die Ergebnisse der Mikrosatellitenanalyse lassen auf die anteilige Existenz von Tumor-DNA in der zellfreien DNA aus der BL schließen, da einerseits deutlich mehr MA in der Gruppe der Tumorpatienten nachweisbar waren und andererseits mehr Tumorpatienten als Kontrollpatienten MA aufwiesen. Eine Diskrimination zwischen den beiden Patientengruppen konnte mit den vorliegenden Untersuchungen allerdings nicht erreicht werden. Die Mikrosatellitenanalyse wurde parallel auch an DNA aus BL-Zellen durchgeführt. Die Untersuchungen ergaben einerseits eine geringere Zahl an Tumorpatienten mit Nachweis von MA andererseits aber auch weniger MA in den tumorfreien Patienten. Darüber hinaus konnten nur sechs konkordante MA in der zellfreien und zellulären DNA detektiert werden, was auf eine unterschiedliche Herkunft der DNA in den beiden Kompartimenten hinweist. Zusammenfassend ist festzustellen, dass die zellfreie DNA aus der BL ein neues Kompartiment für die Lungenkarzinomdiagnostik mit molekularen Markern darstellt.

The early confirmation of the diagnosis of a lung carcinoma is the most significant prognostic factor. New findings concerning diagnostic methods are therefore of paramount importance. The key element of lung carcinoma diagnostics is the bronchoscopy. The recovery of bronchial lavage fluid (BLF) during bronchoscopy is an additional procedure, which is of relevance in tumours that are bronchoscopically not visible (extrabronchially or peripherally located tumours). So far BLF is used only for cytological analysis. In the past cell free DNA was isolated from serum and plasma. By now, it is considered proven that this cell free DNA is at least partially of tumour origin. Based on this knowledge, we asked (i) whether there is cell free DNA detectable in BLF. Additionally we asked about (ii) the quantity and (iii) whether there are tumour associated genetic alterations, i.e. microsatellite alterations, detectable in this DNA. Our studies involved 59 patients (patients), including 30 patients with a confirmed lung carcinoma (24 NSCLC, 6 SCLC) and 29 patients free of a tumour disease with indication for bronchoscopy. For DNA isolation from BL we established two extraction methods, one applying hot phenol and isopropanol and one based on the QiaAMP DNA blood mini kit®. The DNA extraction was successful in all patients. The extraction method based on the QiaAMP DNA blood mini kit® proved to be superior in terms of yielded DNA amount as well as expenditure of time and labour. The cell free DNA was successfully analysed by three different, PCR-based methods (qualitative control of extraction, quantitative real time PCR, microsatellite analysis), which proved sufficient quantity and quality for molecular analysis. For quantification we established a quantitative real time PCR assay first described by Yuan et al.. DNA concentrations in BLF varied massively between patient probes. Per millilitre BLF DNA concentrations varied from 0.1 ng/ml to 3.9 µg/ml, corresponding to a variation of five decadic powers. Microsatellite analysis yielded 19 microsatellite alterations (MA) in cell free DNA, 13 MA in the group of tumour patients and six in those without a tumour. Patients with SCLC showed significant more MA than patients with NSCLC. The results of microsatellite analysis indicated at least partial tumour origin of cell free DNA. This conclusion was supported by the fact that there were more MA in the group of tumour patients and also more tumour patients with � 1 MA. However, a discrimination between groups was not possible. Microsatellite analysis was also performed in DNA isolated from BLF cells. Microsatellite analysis in this compartiment yielded less MA in tumour patients as well as in patients without a tumour. Six MAs showed congruence in cell free DNA and DNA from BLF cells. Based on our findings we concluded that cell free DNA from BLF could be a new compartiment for molecular diagnostics in lung carcinoma.