Der Wadenstecher, Stomoxys calcitrans, verursacht als hämatophage Stechfliege erhebliche Produktionseinbußen in der Milchwirtschaft. Neben Ertragsverlusten durch eine herabgesetzte Tiergesundheit und die damit einhergehende reduzierte Milchleistung, führt auch der Einsatz von Insektiziden zu hohen Kosten in der Landwirtschaft. Zur Bekämpfung von Vektoren und Schadinsekten werden weltweit seit mehreren Jahrzehnten Pyrethroide eingesetzt. Durch den dauerhaften, unkontrollierten Gebrauch kam es zur Entwicklung und Verbreitung von Resistenzen gegenüber Pyrethroiden bei einer Vielzahl von Insektenspezies, darunter S. calcitrans, wodurch die Kontrolle des Lästlings erschwert wird. Die Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) kdr L1014F und kdr-his L1014H im Gen des spannungsabhängigen Natriumkanals (Vssc) wurden mit Pyrethroidresistenz bei S. calcitrans in Verbindung gebracht. Wissenschaftliche Daten über das Vorkommen und die Verbreitung dieser genetischen Marker für Pyrethroidresistenz in S. calcitrans-Populationen in Deutschland fehlen bisher vollkommen. Frühere Untersuchungen auf phänotypischer Ebene indizierten jedoch, dass Pyrethroidresistenz in der deutschen Milchviehhaltung eine weitverbreitete Problematik darstellt. Die weiterführende Erhebung des Resistenzstatus ist für den zielgerichteten und verantwortungsvollen Gebrauch von Insektiziden daher unverzichtbar.
Im ersten Teil dieser Studie konnten mittels topikaler Applikation des Pyrethroids Deltamethrin vier S. calcitrans-Feldisolate von Milchviehbetrieben in Brandenburg als resistent bewertet werden. Anhand des Vergleichs der LD50-Werte der Feldisolate mit dem eines suszeptiblen Referenzstammes ergaben sich Resistenzfaktoren von 46,1 bis 119,5. Die anschließende genotypische Untersuchung der getesteten Fliegen unter Anwendung einer allelspezifischen Realtime-PCR bestätigte den Zusammenhang zwischen dem Deltamethrin-resistenten Phänotyp und dem Vorkommen der Punktmutationen L1014F und L1014H in S. calcitrans. Zudem zeigte sich ein Unterschied in der Stärke der Resistenzausprägung in Abhängigkeit der vorhandenen Resistenzallele. So war in den Feldisolaten mit höheren LD50-Werten das kdr-Allel am häufigsten verbreitet. Die statistische Analyse mittels logistischer Regression bestätigte zudem, dass das kdr-Allel die Überlebenswahrscheinlichkeit nach Kontakt mit Deltamethrin stärker erhöht als das kdr-his-Allel. Ziel des zweiten Abschnitts der Studie war es mittels der Detektion der genetischen Marker kdr und kdr-his eine deutschlandweite Untersuchung von Pyrethroidresistenz in S. calcitrans in Milchviehbetrieben durchzuführen. Zur Erhebung qualitativer und quantitativer Resistenzdaten wurde ein Deep Amplicon Sequencing Assay etabliert und angewandt. Es konnten insgesamt 87 Betriebe in den Bundesländern Schleswig-Holstein, Brandenburg und Baden-Württemberg beprobt werden, wovon letztlich 65 S. calcitrans-Pools sequenziert und analysiert wurden. Die Sequenzierung von jeweils drei verschiedenen Genabschnitten des Vssc ergab, dass die Resistenzallele kdr und kdr-his in allen getesteten Fliegenpopulationen vorkamen. Daraus konnte geschlossen werden, dass Pyrethroidresistenz in Wadenstechern in Deutschland sehr weit verbreitet ist. Die teilweise äußerst geringe prozentuale Häufigkeit des Wildtyps von weniger als 1 % innerhalb einer Population unterstrich den weiten Fortschritt der Ausbreitung der Resistenzallele. Zudem konnte weltweit erstmals eine weitere Mutation, die super-kdr M918T, im Vssc-Gen von S. calcitrans identifiziert werden. Die Mutation ist bisher nur aus Untersuchungen der Muscidae Musca domestica und Haematobia irritans bekannt und wird bei diesen Spezies mit einer höheren Resistenz gegen Pyrethroide assoziiert als die kdr und kdr-his. Sie konnte auf Betrieben in Baden-Württemberg (n = 16) und Brandenburg (n = 3) detektiert werden mit einer relativen Häufigkeit von bis zu 9,5 %. Ob auch ein Zusammenhang zwischen der super-kdr und dem Pyrethroidresistenz-Phänotyp von S. calcitrans besteht, sollte in weiterführenden Studien näher untersucht werden. Die phylogenetische Analyse einer Intronsequenz im dritten Amplikon deutete darauf hin, dass die resistenzassoziierten Mutationen kdr und kdr-his jeweils mindestens zweimal unabhängig voneinander entstanden sind, da sich die identifizierten Haplotypen zwei unterschiedlichen Kladen zuordnen ließen. Der hohe Selektionsdruck, der durch die Anwendung von Pyrethroiden auf Wadenstecher ausgeübt wird, wurde durch dieses Ergebnis zusätzlich unterstrichen. Zum Vergleich wurden außerdem Fliegenproben aus Uganda sequenziert. Diese konnten zum Teil ebenfalls den beiden Kladen zugeordnet werden, was auf eine Verwandtschaft zu den Wadenstechern aus Deutschland hindeutete. Des Weiteren konnten die kdr und die kdr-his zum ersten Mal in Fliegen aus Uganda und gesamt Afrika nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Studie weisen auf die Notwendigkeit eines Monitorings von Pyrethroidresistenz in S. calcitrans hin. Mit dem Deep Amplicon Sequencing Assay wurde eine präzise Methodik etabliert, die eine solche Erhebung und Überwachung von Resistenzdaten erlaubt. Auf der Grundlage von Resistenzdaten sollten einerseits verbesserte Strategien zur Kontrolle von Stechfliegen entwickelt und andererseits anwendende Landwirte und Tierärzte aufgeklärt und sensibilisiert werden.
The stable fly Stomoxys calcitrans is a haematophagous biting insect that causes considerable production losses in dairy industry. In addition to yield losses resulting from reduced animal health and the consequent reduction of milk production, the use of insecticides also represents a significant cost factor in agriculture. To control vectors and pest insects, pyrethroids have been used globally for several decades. As a result of an uncontrolled and continuous use, the development and spread of resistance to pyrethroids has occurred in various insect species including S. calcitrans, which complicates its control. The single nucleotide polymorphisms (SNPs) kdr L1014F and kdr-his L1014H in the voltage-gated sodium channel (Vssc) gene were shown to confer pyrethroid resistance in S. calcitrans. Regarding Germany, scientific data on the occurrence and spread of these genetic markers for pyrethroid resistance in S. calcitrans populations has thus far been lacking. However, previous studies at phenotypic level indicated that pyrethroid resistance poses a widespread problem in German dairy farming. Hence, further investigation of the resistance status is essential for a targeted and responsible use of insecticides. In the first part of this study, four S. calcitrans field isolates from dairy farms in Brandenburg were evaluated as resistant via topical application of the pyrethroid deltamethrin. By comparison of LD50 values of field isolates with a susceptible reference strain, resistancefactors of 46.1 to 119.5 were determined. The subsequent genotypic analysis of the tested flies using allele-specific real-time PCRs confirmed the correlation between a deltamethrinresistant phenotype and the SNPs L1014F and L1014H in S. calcitrans. Furthermore, the level of resistance expression was found to be dependent on the present resistance allele. In field isolates with high LD50 values, the kdr allele was most frequently detected. Statistical analysis using logistic regression confirmed that the kdr allele increased survival probabilities after deltamethrin exposure to a higher degree than the kdr-his allele. The aim of the second part of the study was to conduct a Germany-wide investigation of pyrethroid resistance in S. calcitrans on dairy farms by detection of the genetic markers kdr and kdr-his. A deep amplicon sequencing assay was established and used to collect qualitative and quantitative resistance data. A total of 87 farms in the federal states of Schleswig-Holstein, Brandenburg and Baden-Württemberg were sampled, of which 65 S. calcitrans pools were sequenced and analysed. The respective sequencing of three different amplicons of the Vssc gene revealed the presence of the resistance alleles kdr and kdr-his in all fly populations that were tested. Therefore, it was concluded that pyrethroid resistance is widespread in stable fly populations in Germany. The partly extremely low percentage of less than 1 % of wildtypes within a population emphasized the pervasive spread of resistance alleles. In addition, a further mutation, the super-kdr M918T, was identified worldwide for the first time in the Vssc gene of S. calcitrans. To this point, the mutation had only been known from studies on the Muscidae Musca domestica and Haematobia irritans where it was associated with higher resistance levels to pyrethroids than kdr and kdr-his. The mutation was detected on farms in Baden-Württemberg (n = 16) and Brandenburg (n = 3) with a relative frequency of up to 9.5 %. Whether there is also a correlation between the super-kdr and the pyrethroid resistance phenotype of S. calcitrans requires further investigation. The phylogenetic analysis of an intron sequence in the third amplicon suggested that each of the kdr and kdr-his resistance mutations have at least two independent origins, as the identified haplotypes were assigned to two distinct clades. This result further underlined the presence of intense selection pressure on stable fly populations resulting from a permanent pyrethroid exposure. For comparison, fly samples from Uganda were additionally sequenced. In part, the stable flies from Uganda could also be assigned to both clades, which indicated a relationship to the stable flies from Germany. Furthermore, the alleles kdr and kdr-his were detected for the first time in flies from the African continent and Uganda in particular. The results of this study point out the necessity of monitoring pyrethroid resistance in S. calcitrans. With the Deep Amplicon Sequencing Assay, a precise methodology was established that allows for the collection and monitoring of resistance data. Based on profound resistance data, improved strategies for the control of stable flies should be developed and farmers and veterinarians educated and alerted on the development and spread of resistance.
