Novel insights into Titin’s mobility and function derived from a knock-in mouse model

Abstract

The giant muscle protein titin (up to 3.7 MDa) is a scaffolding protein that extends from the Z-disc to the M-band of the sarcomere and forms a continuous filament system along the myofiber. During muscle development, titin has been proposed to act as a molecular blueprint to enable sarcomere assembly. In mature muscle, titin acts as an adjustable molecular spring that provides elasticity and stability to the sarcomere. Titin’s tight integration into the myofilament and its interaction with multiple structural, regulatory, and contractile proteins has suggested that it is a static protein in the sarcomere. Here we provide evidence that sarcomeric titin may be more dynamic than previously anticipated. To investigate its role in sarcomere assembly and disassembly we used the titin-eGFP knockin mouse, where the fluorescent protein eGFP is attached to titin’s C terminus flanking the M-band region of the sarcomere. This model provides the first tool to investigate the expression and localization of titin in striated muscle in real time. In non muscle cells titin is expressed at low levels so that the fluorescent signal is under the detection limit of current fluorescent microscopes. We studied titin’s mobility using FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) and found that calcium is the main determinant of titin dynamics. This effect is independent from calcium-induced contraction and could reflect changes in the affinity of titin to actin. Titin dynamics was independent from protein biosynthesis, but depended on protein degradation. We determined that movement of titin molecules and not myofibril rearrangement was the main mechanism for fluorescent recovery. Neither domain composition nor developmental stage led to changes in titin’s mobility, which was equally efficient along and across the myofiber. These results suggest a model where the largely unrestricted movement of titin within and between sarcomeres largely depends on calcium. Our findings have implications for skeletal muscle and cardiac disease, as the stability and remodeling of the myofilament determine its ability to regenerate and adapt to a changing environment.

Das Muskelprotein Titin ist außergewöhnlich groß (bis zu 3,7 MDa) und erstreckt sich von der Z Scheibe bis zur M Bande des Sarkomeres und bildet dabei ein kontinuierliches Filamentsystem entlang der Myofibrille. Während der Entwicklung der Muskelfibrillen fungiert Titin als Gerüstsystem und ermöglicht den Aufbau der Sarkomere. Titin enthält elastische Domänen, welche die mechanischen Eigenschaften des Myofilaments bestimmen. Als Gerüstprotein ist Titin fest in das Sarkomer integriert und interagiert mit unterschiedlichen strukturellen, regulatorischen und kontraktilen Proteinen. Entgegen der vorherrschenden Meinung, dass Titin stabil im Sarkomer fixiert ist, zeigen unsere Studien eine unerwartete Mobilität für ein Protein seiner Größe. Zur funktionellen Untersuchung von Titin beim Auf- und Abbau von Sarkomeren haben wir die Titin-eGFP Knockin-Maus verwendet, bei der Titins C Terminus im Bereich der M-Bande durch das Fluoreszenzprotein eGFP markiert ist. Das Mausmodell ermöglichte es uns die Expression und Lokalisation von Titin im quergestreiften Muskel in Echtzeit zu untersuchen. Aufgrund der geringen Expression von Titin in Nichtmuskelzellen konnte ein Fluoreszenzsignal mit der aktuell verfügbaren Mikroskopietechnik nicht detektiert werden. Die Untersuchung der Mobilität von Titin im Sarkomer erfolgte mittels FRAP (Fluorescence Recovery after Photobleaching) und zeigte, dass diese insbesondere durch Kalzium beeinflusst wird. Der Kalzium-Effekt war unabhängig von der Kontraktion und könnte damit auf einer veränderten Affinität von Titin zu Aktin beruhen. Die Dynamik von Titin war abhängig vom Proteinabbau, aber nicht von der Proteinbiosynthese. Insgesamt spielt die Verschiebung von Myofibrillen im Vergleich zur Bewegung von Titin-Molekülen nur eine untergeordnete Rolle bei der Wiederherstellung des Fluoreszenzsignals. Weder die Domänenstruktur noch der Entwicklungsstand führten zu Veränderungen in der Mobilität. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass die weitgehend uneingeschränkte Bewegung von Titin-Molekülen innerhalb und zwischen Sarkomeren hauptsächlich durch Kalzium beeinflusst wird. Unsere Untersuchungen sind insbesondere für Skelettmuskel- und Herzmuskelerkrankungen relevant, da Umbauprozesse und Stabilität des Myofilaments die Möglichkeit zur Regeneration und Anpassung an veränderte Umweltbedingungen bestimmen.