Suche, Reinigung und Identifizierung von Urotensin-II-generierenden Enzymen in humanem Plasma

Abstract

Es war das Ziel dieser Arbeit, ein Urotensin-II generierendes Enzym in humanem Plasma nachzuweisen, aufzureinigen und zu identifizieren. Zum Nachweis der UCE-Aktivität wurde das Massenspektrometrie-basierte Enzym Screening System (MES-System) genutzt. Nach vier chromatographischen Reinigungsschritten wurde eine nahezu homogene Fraktion mit UCE-Aktivität gewonnen. In dieser Fraktion wurde mit der LC-ESI MS/MS die Protease Komplement-Faktor-I identifiziert. Durch den Nachweis der UCE-Aktivität in einer kommerziellen Komplement- Faktor-I-Fraktion konnte die Richtigkeit der Identifizierung bestätigt werden. Die gereinigte homogene Fraktion ihrerseits hydrolysierte ein typisches Komplement-Faktor-I-Substrat. Die gereinigte und die kommerzielle Komplement- Faktor-I-Fraktion zeigten die gleiche Subtratspezifität und ein identisches Verhalten gegenüber Inhibitioren. N-glykosidisch gebundene Zuckerreste konnten sowohl in der aufgereinigten homogenen Fraktion als auch der Komplement- Faktor-I-Fraktion gefunden werden. Versuche zur Molekulargewichtsabschätzung des UCE lagen in der Größenordnung des Molekulargewichts des Komplement- Faktors-I. Die Generierung von UII durch den Komplement-Faktor-I scheint bei Entzündungsreaktionen eine Rolle zu spielen. Möglicherweise ist UII für biologische Effekte einer Entzündungsreaktion verantwortlich. Mit dieser Arbeit ist es gelungen ein UCE, den Komplement-Faktor-I, zu identifizieren und eine mögliche Verbindung zwischen UII und dem Komplementsystem herzustellen.

The aim of the study was to find, purify and identify an urotensin-II converting enzyme (UCE) in human plasma. The MES-system (mass spectrometry assisted enzyme-screening system) was used for the detection of the UCE activity. In a homogeneous fraction, which was obtained after four chromatographic purification steps, the protease complement factor I was identified. The identity was verified by detecting urotensin-II generating activity in a commercial complement factor I fraction. Furthermore it was shown that the purified active fraction hydrolyzed a typical complement factor I substrate. Both, the purified fraction and the complement factor I fraction, showed identical substrate specificity. The purified fraction and the complement factor I fraction both were inhibited by aprotinin and pefabloc SC, two serine protease inhibitors. Both the UCE and the complement factor I fraction have N-linked oligosaccharide type polysaccharide chains. The molecular weight of UCE is identical with the complement factor I. Urotensin- II (UII) seems to be an important factor in inflammation. It is responsible for biological effects of inflammatory reaction. In conclusion, the complement factor I is identified as an UCE and UII is associated with inflammation and the complement system.