Das Neuroblastom gehört zu den häufigsten malignen Neoplasien im Kindesalter. Etwa die Hälfte der Patient:innen hat trotz intensiver, multimodaler Therapie ein hohes Risiko für ein Rezidiv und einen krankheitsbedingten Tod. Bei einem Drittel dieser Hochrisikopatient:innen treten genomische Rearrangements des Telomerase Reverse Transcriptase Gens (TERT) auf, die eine erhöhte TERT Transkription und Telomerase-Aktivierung bewirken. TERT rearrangierte Patient:innen haben ein hohes und bei zusätzlichen Mutationen im RAS/MAPK/ALK Signalweg ein sehr hohes Risiko für ein Rezidiv. Aktuell fehlen für diese Patient:innen jedoch Möglichkeiten für eine molekulare Echtzeitdiagnostik. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer Methode für das Monitoring der Krankheitsaktivität dieser Hochrisikogruppe mit Liquid Biopsy Analysen. Zur Detektion und Quantifizierung der TERT Rearrangement Bruchpunkte haben wir basierend auf Panel-Sequenzierungsdaten individuelle Droplet Digital PCR (ddPCR) Assays entwickelt. Zunächst wurde Zelllinienmaterial – genomische DNA (gDNA) und zellfreie DNA (cfDNA) aus konditioniertem Medium – untersucht. Anschließend analysierten wir gDNA aus Xenograft-Tumoren und cfDNA aus dem Mausblut. Nach Etablierung dieser präklinischen Modelle folgte die Untersuchung von Patient:innenproben: gDNA aus Tumorgewebe und Knochenmark sowie cfDNA aus Blut- und Knochenmarkplasma. Bei Patient:innen mit bekannten Alterationen analysierten wir zudem die ALK Kopienzahl und die ALK p.R1275Q Mutation. Die Ergebnisse der longitudinal gesammelten Patient:innenproben wurden mit dem diagnostischen Goldstandard verglichen. Außerdem entwickelten wir ein ddPCR-Assay zur Bestimmung der TERT Kopienzahl in Triplex-Reaktionen. In den 16 Neuroblastom Zelllinien zeigte sich bei vier, darunter drei mit bekanntem TERT Rearrangement, ein eindeutiger TERT Gain und in einer Zelllinie ein partieller TERT Verlust. Die Patient:innen (n=4) hatten einen diploiden TERT Status. Eine Herausforderung beim Design der Bruchpunkt-Assays war die repetitive und GC-reiche Region, die jedoch in der Mehrzahl der Fälle erfolgreich überwunden wurde. Für eine zuverlässige Detektion der individuellen Bruchpunkte genügen, je nach Assay, bereits 0,05 ng an Input-DNA. Die Analyse der TERT Bruchpunkte in cfDNA verbesserte die Beurteilung der minimalen Resterkrankung sowie die Früherkennung von Rezidiven bei den hier untersuchten Patient:innen. Zudem gelang der Nachweis der TERT Bruchpunkte in cfDNA aus der Knochenmarknische, einem häufigen Ursprungsort von Rezidiven. Hier wurden die Biomarker häufiger in der cfDNA als in der standardmäßig untersuchten gDNA detektiert. Die entwickelten ddPCR-Assays eignen sich für den klinischen Einsatz und können zur Analyse von TERT Bruchpunkten in Liquid Biopsies verwendet werden – allein oder in Kombination mit weiteren Analysen. Die TERT Rearrangement Bruchpunkte in der cfDNA sind robuste Biomarker zur Überwachung der Krankheitsaktivität der betroffenen Patient:innen.
Neuroblastoma is one of the most common pediatric malignancies. Despite receiving aggressive multimodal therapy approximately half of the patients diagnosed with neuroblastoma have a high risk of relapse or cancer-related death. One-third of high-risk neuro blastoma patients harbor rearrangements of the telomerase reverse transcriptase gene (TERT), leading to increased TERT transcription and telomerase activity. A mechanistic classification defines neuroblastomas with telomere-maintenance mechanisms such as TERT rearrangements as high risk. If co-occurring with alterations in the RAS/MAPK/ALK pathway, these cases form a very-high-risk subgroup. However, molecular real-time diagnostic tools for TERT rearranged neuroblastomas remain limited to date. Our aim was to establish a liquid biopsy-based monitoring strategy for this vulnerable patient subgroup. Based on panel sequencing data we developed tumor-specific droplet digital PCR (ddPCR) assays to detect and quantify unique TERT rearrangement breakpoints. First, we analyzed cell line material – genomic DNA (gDNA) and cell free DNA (cfDNA) from conditioned medium. Next, gDNA from xenograft-tumors and cfDNA from mouse blood were tested. After establishing these preclinical models, we analyzed patient material: gDNA from tumors and bone marrow and cfDNA from blood plasma and bone marrow plasma. In patients with known ALK alterations we also assessed the ALK copy number or allelic ALK p.R1275Q mutation. Marker detection in longitudinally collected patient samples was compared to the current gold standard diagnostics. Additionally, we designed a ddPCR assay to analyze the TERT copy number using triplex reactions. Sixteen neuroblastoma cell lines were analyzed and four – three of which harbored a TERT rearrangement – showed a clear TERT gain, while one exhibited a partial TERT loss. All four patients analyzed had a diploid TERT status in cfDNA and tumors. Designing the assays for detecting TERT rearrangement breakpoints posed a challenge due to the repetitive and GC-rich genomic region. However, this obstacle was successfully overcome in most cases. Notably, small amounts such as 0.05 ng input DNA were sufficient for a reliable detection of TERT rearrangement breakpoints. The detection of these unique breakpoints in liquid biopsies improved assessment of the therapeutic response and early relapse detection in patients within this study. We demonstrated that TERT breakpoints are detectable in cfDNA from the bone marrow niche, a frequent site of relapse. Here we even saw that biomarkers were more often detected in cfDNA than in the gDNA, which is commonly analyzed in clinical routine tests. The newly developed ddPCR assays for the TERT rearrangement breakpoint detection are suitable for clinical use, either on their own or in combination with analyses of RAS/MAPK/ALK pathway alterations. TERT rearrangement breakpoints in cfDNA are robust biomarkers for monitoring disease activity in affected patients.
