Einleitung: Die Graft versus Host Disease ist eine häufige Komplikation der hämatopoietischen Stammzelltransplantation. Eine sichere Vorhersage ist derzeit nicht möglich. Eine Kokultur aus T-Zellen von Stammzellspendenden sowie antigenpräsentierenden Zellen der zugehörigen Stammzellempfangenden könnte das Potential bergen, anhand der Marker CD40L und 4-1BB die konventionelle und regulatorische T-Zellantwort getrennt zu betrachten und eine akute Graft versus Host Disease vorherzusagen. Methoden: Aus dem Vollblut von Stammzellempfangenden Personen und den zugehörigen Stammzellspendenden wurden mittels AutoMACS® und magnetischer Beads eine CD3 negative Zellpopulation, die antigenpräsentierende Zellen enthält, und eine CD4 positive Zellpopulation, die aus T-Zellen besteht, gewonnen und in Kokultur gebracht. Anschließend wurde der Anteil an regulatorischen T-Zellen sowie die Expression der Oberflächenmarker 4-1BB und CD40L auf CD4 positiven Zellen in der Kokultur ausgewertet und zwischen Proben von Stammzellempfangenden, die eine Graft versus Host Disease entwickelten und Stammzellempfangenden ohne Graft versus Host Disease sowie nicht HLA-identischen Kontrollen verglichen. Die T-Zellen aus einer solchen Kokultur wurden außerdem mittels einer RNA-Sequenzierung näher untersucht. Des Weiteren wurde diesen Kokulturen Interleukin-2 in verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt, um den Effekt dieses Interleukins auf die Kokultur zu evaluieren. Ergebnisse: In der RNA-Sequenzierung konnte die Identifikation von regulatorischen T-Zellen und konventionellen T-Zellen anhand der Marker 4-1BB und CD40L bestätigt werden. Die Zugabe von Interleukin-2 hatte dagegen keine relevanten Auswirkungen auf die regulatorischen T-Zellen in der Kokultur. Es konnten weitere mögliche Oberflächenmarker für diesen Assay wie LRRC32, CTLA4, IL12RB2 identifiziert werden. In der Zellseparation konnte eine Reduktion oder Anreicherung der erforderlichen Zellen um etwa eine Größenordnung erreicht werden. Die Auswertung der Kokulturen ergab einen signifikant niedrigeren Anteil von regulatorischen T-Zellen an CD4 positiven Zellen bei Proben von Stammzellempfangenden, die eine Graft versus Host Disease entwickeln würden. Ein statistisch signifikanter Unterschied in der Expression von 4-1BB und CD40L zeigte sich im Hinblick auf eine Graft versus Host Disease nicht. Diskussion: Die RNA-Sequenzierung und Versuche zum Einfluss von Interleukin-2 auf den Assay zeigten eine an sich robuste und reproduzierbare Alloreaktion. In der Anwendung bei Stammzellempfangenden zeigte sich ein verminderter Anteil an regulatorischen T-Zellen bei Proben von Stammzellempfangenden, die eine Graft versus Host Disease entwickeln würden. Die Alloreaktion blieb allerdings schwach im Vergleich zu den Kontrollen, sodass eine Vorhersage einer Graft versus Host Disease anhand der Expression von 4-1BB und CD40L nicht möglich war.
Introduction: Graft-versus-host disease (GvHD) is a common complication following hematopoietic stem cell transplantation and is mediated by T cells. Currently, a reliable prediction of GvHD is not possible. A co-culture of T cells from the stem cell donor and antigen-presenting cells from the corresponding stem cell recipient might have the potential to predict GvHD. This could be achieved by separately identifying the response to this allogeneic stimulus from regulatory T cells via 4-1BB and from conventional T cells via CD40L. Methods: Co-cultures were established from CD3-negative cells and CD4-positive mononuclear cells from peripheral blood of non-HLA-identical samples at a 1:1 concentration for 16 hours. The required cells were previously separated from peripheral blood cells using an AutoMACS® and magnetic beads. RNA sequencing was performed to compare the CD4 lymphocytes expressing 4-1BB or CD40L with the double-negative lymphocytes. Additionally, interleukin-2 was added to these co-cultures in various concentrations to evaluate the effect of the interleukin on the co-culture. Finally, CD4-positive mononuclear cells from peripheral blood of stem cell donors were co-cultured with a CD3-negative cell fraction from the corresponding stem cell recipient. The proportion of regulatory T cells and the expression of the surface markers 4-1BB and CD40L on CD4-positive cells were then evaluated and compared between samples from stem cell recipients who developed Graft versus Host Disease and those who did not, as well as unmatched controls. Results: RNA sequencing confirmed the identification of regulatory T cells and conventional T cells based on the markers 4-1BB and CD40L. However, the addition of interleukin-2 had no significant effect on regulatory T cells in the co-culture. Additional potential surface markers for this assay, such as LRRC32, CTLA4, and IL12RB2, were identified. In cell separation, a reduction or enrichment of the required cells by about an order of magnitude was achieved. The evaluation of the co-cultures showed a significantly lower proportion of regulatory T cells among CD4-positive cells in samples from stem cell recipients who would develop GvHD. However, there was no difference in the differential expression of 4-1BB and CD40L concerning the development of GvHD. Discussion: The RNA sequencing and experiments on the influence of interleukin-2 on the assay demonstrated a robust and reproducible alloreaction. In application to stem cell recipients, a reduction of regulatory T cells was observed in samples from recipients who would develop GvHD. However, the stimulation in the alloreaction remained very weak compared to controls, making it impossible to predict GvHD based on the expression of 4-1BB and CD40L.
