Limb-girdle muscular dystrophies (LGMD) are a heterogeneous group of slowly progressive muscular dystrophies. Mutations in the dysferlin gene cause LGMD 2B, Miyoshi myopathy (MM) and distal anterior compartment myopathy (DACM) commonly referred to as dysferlinopathies. Dysferlin is a transmembrane protein and its subcellular localization is predominantly allocated to the plasma membrane, but also to developing T-tubules and intracellular vesicles. At the sarcolemma, dysferlin was shown to be crucial for efficient membrane repair, although it has been proposed to have a role in many other cellular functions. LGMD 1C is caused by mutations in the caveolin-3 (cav-3) gene. Cav-3 is the muscle-specific isoform of the caveolin protein family which represent, together with the cavin protein family, the major structural and functional components of caveolae. Caveolae are plasma membrane invaginations and belong to a specialized type of membrane microdomains referred to as lipid rafts. Cav-3 is known to regulate dysferlin localization and rate of endocytosis at the plasma membrane. Recently, recessive mutations in the anoctamin gene could also be related to LGMDs. As seen for dysferlinopathies, ANO5 mutations can lead to a LGMD or MM clinical phenotype. Anoctamin-5 is a member of the anoctamin protein family and is thought to function as calcium- activated chloride channel. In order to reveal the molecular mechanisms underlying LGMD and to investigate the putative interactions of dysferlin, cav-3, and ano5, experiments on primary skeletal muscle cell lines with disease-related mutations in DYSF, CAV3, and ANO5 have been analyzed in this study. Immunolabeling studies revealed that dysferlin and cav-3 are partially colocalized in vesicular structures at the plasma membrane of human primary myotubes. Biochemical purification of lipid rafts from differentiated myotubes showed that dysferlin is associated with lipid rafts linked to the actin- cytoskeleton. Transmission electron microscopy analysis of myotubes derived from skeletal muscle of LGMD patients revealed alterations of caveolae abundance at the plasma membrane correlating with the disease-causing mutations. Ultrastructural studies on the subcellular localization of dysferlin showed plasma membrane, but also intracellular localization in cytosolic vesicles. Immunopurification of intracellular dysferlin-containing vesicles revealed the presence of cav-3 and other known dysferlin interacting partners. These vesicles were found to contain approximately 500 proteins detected by proteomics. Results from this study show that caveolae play a crucial role in the context of LGMD. Especially for LGMD 2B, caveolae abundance at the plasma membrane in human primary myotubes can be correlated with LGMD-causing mutations. Furthermore, we propose that dysferlin function during membrane repair is mediated by actin-linked lipid raft formation. Our results confirm that dysferlin is localized in cytosolic vesicles, which are involved in multiple cellular processes such as vesicle transport, endo- and exocytosis, cell-adherence, and lipid raft dynamics. Taken together, the close association of dysferlin and cav-3, especially in context to caveolae, could be demonstrated in this study.
Als Gliedergürtelmuskeldystrophien (LGMD) bezeichnet man eine heterogene Gruppe von Muskeldystrophien, die sich durch einen progressiven Krankheitsverlauf mit Schwächung der Skelettmuskulatur auszeichnet. Mutationen im Dysferlin-Gen (DYSF) führen primär zu zwei klinischen Ausprägungen; der LGMD Typ 2B und der Miyoshi Myopathie. Dysferlin ist ein Transmembranprotein, welches am Sarkolemm des Skelettmuskels sowie in entwickelnden T-Tubuli und innerhalb der Muskelfaser lokalisiert ist. Es spielt eine zentrale Rolle bei Membranreparatur nach Verletzung in Muskelzellen. Eine weitere Form der Gliedergürtelmuskeldystrophie, die autosomal-dominant vererbbare LGMD Typ 1C, wird durch Mutationen im Caveolin-3-Gen (CAV3) hervorgerufen. Caveolin-3 ist eine muskelspezifische Isoform der Caveolinproteinfamilie. Caveoline sind wichtige strukturelle- sowie funktionelle Komponenten von sogenannten Caveolae. Dies sind Plasmamembraneinstülpungen, die sich essenziell in ihrer Protein- und Lipidzusammensetzung von ihrer Membranumgebung unterscheiden und daher auch als „Lipid rafts“ bezeichnet werden. Die Gliedergürtelmuskeldystrophie LGMD Typ 2L wird durch Mutationen im Anoctamin-5-Gen (ANO5) hervorgerufen und zeigt im klinischen Bild eine große Ähnlichkeit zur LGMD Typ 2B. Anoctamin-5 gehört zur Anoctaminproteinfamilie. Anoctamine bestehen aus acht Transmembrandomänen und sollen als Kalzium- aktivierte Chloridkanäle wirken. Um molekularen Prozesse in LGMD zu entschlüsseln, wurden Untersuchungen an primären Zelllinien, isoliert aus Skelettmuskelbiopsien von verschiedenen LGMD-Patienten mit Mutationen in DYSF, CAV3 und ANO5 durchgeführt. Immunozytologische Studien an humanen Skelettmuskelzellen zeigten, dass Dysferlin und Caveolin-3 partiell an der Zellmembran kolokalisieren und in intrazellulären, vesikulären Strukturen zu finden sind. Biochemische Untersuchungen von Lipid rafts, die in Zusammenhang mit dem Aktin-Zytoskelett stehen, führte zu der Erkenntnis, dass Dysferlin an diese assoziiert ist. Elektronenmikroskopische Analysen von Muskelzellen von LGMD Typ 2B-Patienten konnten zeigen, dass die Caveolaeanzahl an der Plasmamembran mit der Schwere verschiedener Dysferlinmutationen korreliert. Durch Proteomanalysen aufgereinigter intrazellulärer Dysferlinvesikel wurden circa 500 Proteine detektiert, welche bereits beschriebene sowie neue mögliche Dysferlininteraktionspartner repräsentieren. Die Ergebnisse dieser Studie bestätigen, dass Dysferlin und Caveolin-3 in engem funktionellen Zusammenhang stehen, und dass Caveolae eine entscheidende Rolle im Kontext zu LGMD spielen. Dysferlin ist neben der Zellmembran wesentlich in intrazellulären zytosolischen Vesikeln lokalisiert. Diese dysferlinhaltigen Vesikel scheinen eine wesentliche Rolle in multiplen zellulären Prozessen wie dem vesikulärem Transport, der Endo- und Exozytose, der Zelladhäsion, der Aktin-regulierten Signaltransduktion sowie „Lipid raft“-Dynamiken zu spielen.
