Acute Myeloid Leukemia (AML) presents a complex therapeutic challenge largely driven by its genetic heterogeneity. Among the genes recurrently mutated in AML, Additional Sex Combs-Like 1 (ASXL1) is notable for its association with adverse clinical outcomes. To better understand the contributions of ASXL1 mutations to leukemogenesis, I established a complementary Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) activation/interference (CRISPRa/i) screening platform in murine interleukin-3 (IL-3) dependent 32Dcl3 myeloid progenitor cells stably expressing wildtype, mutant (Asxl1Y588X), or control Asxl1 constructs. By withdrawing IL-3, I aimed to identify the ASXL1-linked genetic networks that enable growth factor-independent proliferation, thereby shedding light on the mechanisms by which ASXL1 mutations confer a proliferative advantage in AML. To validate the CRISPRa/i technology, I first characterized the 32Dcl3 cells using pooled sgRNA libraries targeting apoptosis- and cancer-related genes, successfully identifying Colony-Stimulating Factor 2 (Csf2) as a key dependency marker. Building on this validation, I then screened Asxl1 wildtype, mutant, and control cells and identified multiple proliferation-associated genes. Among these, Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member B (Anp32b) stood out for exhibiting distinct, growth-promoting effects in both wildtype and mutant Asxl1-expressing 32Dcl3 cells. These findings confirmed the functionality of the CRISPRa/i platform and provided physiologically relevant expression insights not captured by conventional CRISPR knockout methods. Despite methodological constraints, including a limited number of replicates and the strong selection pressure imposed by IL-3 withdrawal, these results offer a robust foundation for identifying genetic interactions and dependencies in ASXL1-mutated AML. Moving forward, candidate genes and pathways highlighted in these screens can be further validated in vitro and in vivo, ultimately advancing our understanding of AML pathogenesis and guiding the development of targeted therapies.
Die akute myeloische Leukämie (AML) stellt aufgrund ihrer genetischen Heterogenität eine komplexe Erkrankung dar. Unter den in AML gehäuft auftretenden Mutationen ist Additional Sex Combs-Like 1 (ASXL1) hervorzuheben, da sie mit einer schlechten Prognose assoziiert ist. Um die Rolle von ASXL1-Mutationen in der Leukämogenese besser zu verstehen, habe ich eine komplementäre Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Aktivierungs/-Interferenz (CRISPRa/i) Screening-Plattform in murinen, Interleukin-3 (IL-3)-abhängigen 32Dcl3-Vorläuferzellen etabliert. Diese Zellen exprimieren stabil Wildtyp-, mutierte (Asxl1Y588X)- oder Kontroll-Asxl1-Konstrukte. Durch den Entzug von IL-3 war das Ziel, Asxl1-assoziierte genetische Netzwerke zu identifizieren, die eine wachstumsfaktorunabhängige Proliferation ermöglichen, um so Mechanismen aufzudecken, durch die ASXL1-Mutationen in AML einen Proliferationsvorteil vermitteln. Zur Validierung der CRISPRa/i-Technologie charakterisierte ich zunächst die 32Dcl3-Zellen mithilfe gepoolter sgRNA-Bibliotheken, die apoptose- und krebsrelevante Gene abdecken. Dabei gelang es, Csf2 als Schlüsselfaktor für ein IL-3-unabhängiges Zellwachstum zu identifizieren. Aufbauend auf diesen Ergebnissen untersuchte ich anschließend Asxl1-Wildtyp-, Asxl1Y588X- und Kontrollzellen und identifizierte mehrere proliferationsassoziierte Gene. Besonders hervorgetreten ist dabei Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member B (Anp32b), das sowohl in Wildtyp- als auch in mutierten Asxl1-Zellen deutliche proliferationsfördernde Effekte zeigte. Diese Ergebnisse bestätigen die Funktionalität der CRISPRa/i-Plattform und liefern physiologisch relevante Einblicke in Genexpressionsmuster, die mit herkömmlichen CRISPR-Knockout-Methoden nicht erfasst werden können. Trotz methodischer Einschränkungen wie der begrenzten Anzahl an Replikaten und dem starken Selektionsdruck durch IL-3-Entzug bieten diese Resultate eine solide Grundlage, um genetische Interaktionen und Abhängigkeiten in der ASXL1-mutierten AML näher zu beleuchten. Im nächsten Schritt können die in diesen Screenings identifizierten Kandidatengene und Signalwege sowohl in vitro als auch in vivo weiter validiert werden, um unser Verständnis der AML-Pathogenese zu vertiefen und neue, zielgerichtete Therapieansätze zu entwickeln.
